2021 Fiscal Year Research-status Report

クローン病における小腸特異的細菌の探索と感受性遺伝子TNFSF15の関連性の解明

Research Project

Project/Area Number	19K08401
Research Institution	Jichi Medical University
Principal Investigator	山本博徳自治医科大学, 医学部, 教授 (10311937)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	矢野智則自治医科大学, 医学部, 准教授 (30438634) 三浦光一自治医科大学, 医学部, 准教授 (90375238) 永山学自治医科大学, 医学部, 助教 (80741347)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2023-03-31
Keywords	クローン病 / 小腸細菌叢 / 粘膜関連菌 / ダブルバルーン小腸内視鏡
Outline of Annual Research Achievements	クローン病で病変の主体となる小腸から腸内細菌を回収し、解析を行った。(1)クローン病患者27例と対照患者（小腸疾患のない患者またはクローン病以外の小腸疾患を有する患者）17例からダブルバルーン小腸内視鏡を用いて小腸サンプル（粘膜生検または粘膜擦過サンプル）を収集した。(1)細菌叢解析では合計2,260 のoperational taxonomic units (OTUs)が得られ、統計学的に2群間に有意な違いが見られた(Bray-Curtis distanceに基づく比較)。Phylum（門）レベルではProteobacteria門とBacteroidetes門がクローン病に多く、family（科）レベルではEnterobacteriaceae科、Ruminococcaceae科、Bacteroidaceae科がクローン病に多く認められた。逆にFirmicutes 門、Streptococcaceae科はクローン病で少なかった。さらに菌種レベルではEscherichia coli、Ruminococcus gnavusをはじめとする18菌種がクローン病に多く認められた。クローン病小腸から得られた上記18菌種のうちEscherichia coli、Ruminococcus gnavus を含む9菌種を単離し得た。(2)次に、この9菌種を個別に培養し混合した菌液を無菌マウスに経口投与して、3週間後に腸管粘膜固有層の免疫細胞を解析したところ、大腸において強いinterferon-γ+CD4+T細胞（1型ヘルパーT細胞; TH1細胞）と弱いinterleukin-17+CD4+T細胞（17型ヘルパーT細胞; TH17細胞）の誘導を認めた。(3)上記９菌種のうち、クローン病から分離したE. coliを無菌化野生型マウスに移植し、抗IL-10R抗体を投与すると小腸に強い炎症が生じた。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 本研究の目標のうち、(1)小腸サンプルの収集と細菌叢解析によるクローン病関連菌の特定と、(2)無菌マウスを用いたクローン病関連菌による腸管免疫細胞の動態解析(3)クローン病関連菌を無菌マウスに移植し、腸炎の悪化を確認し、これら結果は論文報告した (Nagayama M, Yano T, Miura K, Yamamoto H, et al. Gut Microbes 2022;12:e1788898)。さらに分離したE.coliとTNFSF15との関連を解析中である。
Strategy for Future Research Activity	E.coliを無菌マウスに移植した際に生じ腸炎に関して、TNFSF15/DR3シグナルの関与の検証をTnfsf15およびDr3の遺伝子発現を解析する予定である。またクローン病から分離したE.coli以外の菌についても検討予定である。さらにE.coli内でもでも菌株の違いが影響する可能性についても解析を検討する。腸炎誘導の評価として、組織学的評価、血中LPS-binding protein (LBP)濃度、腸上皮の遺伝子発現（Tnfを含む炎症性サイトカイン、tight junction等）を行い、腸炎誘導能を評価する。
Causes of Carryover	新型コロナウイルス感染症の蔓延で、学内の研究活動の制限が加わり、一部課題は達成できなかった。しかし引き続き、クローン病と小腸細菌叢の関連について研究を継続しており、次年度以降の研究費として使用予定である。