2019 Fiscal Year Research-status Report
大腸がんの内視鏡生検検体を用いた腸内細菌機能の定量化による発がんへの関与の解明
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19K08416
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| Research Institution | Tokyo Institute of Technology |
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Principal Investigator |
水谷 紗弥佳 東京工業大学, 生命理工学院, JSPS特別研究員 (70790278)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 大腸がん / 内視鏡生検 / 腸内細菌 / メタゲノム / メタトランスクリプトーム |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、大腸がんの前がん病変であるポリープや粘膜内がんのような小さい病変に局在する細菌の機能を定量的に解析することを目的として、大腸内視鏡生検検体を用いたメタゲノム・メタトランスクリプトーム解析の方法論確立のためのパイロット研究を行う。国立がん研究センターで大腸内視鏡下生検により収集済みの約80被験者の腫瘍部位と正常粘膜のうち、大腸がん患者5人の腫瘍部位と正常粘膜（計10検体）を対象試料としている。生検試料を用いたメタゲノム・メタトランスクリプトーム解析は技術的に確率されておらず、DNA・RNAの抽出方法や配列決定方法を独自に模索する必要がある。その第一歩として2019年度は、文献調査や国内外の学会へ参加することにより情報を収集し、生検試料から細菌由来のDNA・RNAを抽出するプロトコル作成を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
ヒト粘膜生検試料からの細菌由来DNA・RNAの抽出は既報のプロトコルがないため、使用可能な抽出キットなどをメーカーに照会などしたが、メーカーでも粘膜生検試料への仕様適性などは確認しておらず、仕様可能性が確認できなかった。特に、ヒト粘膜生検試料から抽出できる細菌由来DNA・RNAは非常に微量であることが考えられるため、後のステップである配列決定に耐えうるだけのDNA・RNA量が確保できるかは模索の必要があることがわかった。また、マウス盲腸など類似試料に使用された既報のプロトコルを模倣する場合にも、試薬が生産終了しているなどの困難な状況にある。そのため、当初計画では、2020年度に、粘膜生検試料から細菌由来全DNA・RNA抽出を開始する予定であったが、実験を開始することができなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
2020年度は、第一に、既報のプロトコルを用いた16S rRNAアンプリコン配列法を用い、本研究代表者らがこれまで糞便試料を用いて得た大腸がんの関連細菌に関する知見を粘膜生検レベルで再確認する。16S rRNA遺伝子の配列決定は外部機関に委託（有償）する。配列データは全て東京工業大学山田研究室の計算サーバーに保管し、同研究室で構築済みのパイプラインを用いて情報解析を行う。第二に、2019年度に引き続き、共同研究先の協力を得て、粘膜生検試料からの細菌由来全DNA・RNAの抽出方法を模索し、全ゲノムシーケンスによるメタゲノムデータとRNA-Seqによるメタトランスクリプトームデータを取得する。ライブラリの作成や配列決定は外部機関に委託（有償）し、リード数の多いillumina NovaSeq 6000を用いる。同研究室でこれまで蓄積してきた糞便メタゲノムデータや、先行研究による糞便メタトランスクリプトームデータを比較対象とし、粘膜生検試料のメタゲノム・メタトランスクリプトームデータの性能評価を行う。
2021年度は、上記で算出したメタゲノム・メタトランスクリプトームデータを腫瘍部位と正常粘膜とで比較し、腫瘍部位に特徴的に存在する細菌や細菌遺伝子を検出する。細菌の代謝遺伝子の理解には同研究室で開発を進めている腸内細菌の代謝経路データベースEnteroPathwayや既存の知識データベースKyoto Encyclopedia of Genes and Genomesを利用する。
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| Causes of Carryover |
理由：2019年度に開始予定であった実験を翌年度以降に変更したため。
使用計画：2020年度に実施予定の実験の試薬を購入する、シーケンスを外注する。
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