自己免疫性肝炎におけるエクソソームの網羅的解析と病態への関与

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K08447
• Research Institution: Fukushima Medical University
• Principal Investigator: 大平 弘正 福島県立医科大学, 医学部, 教授 (90274951)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 自己免疫性肝炎 / エクソソーム / microRNA

Outline of Annual Research Achievements

自己免疫性疾患である自己免疫性肝炎(AIH)は原因が不明であり、疾患特異的マーカーの同定や病態解明ならびに治療抵抗例に対する治療法開発が急務となっている。細胞から体液中に分泌される脂質二重膜小胞「エクソソーム」はタンパク質や核酸を内包し、癌転移や免疫応答など種々の生体内イベントに関与している。また、エクソソームを標的・活用した治療法の開発も検討されている。本研究では、AIH患者血液中のエクソソームの網羅的microRNA解析を行い、疾患特異的なmicroRNAの同定することを目的とする。
今年度は、先ず、エクソソームの網羅的miRNA解析として、同意の得られたAIH4例、正常ホボランティア4例の血清からexoRNeasy Serum Plasma Kits (QIAGEN)を用いてエクソソームを抽出した。抽出に成功し濃度測定の後, microRNAの網羅的解析を行なった。microRNAアレイ解析結果から正常者と有意差のある上位3つのmiR-7877-5p、miR-6806-5p、miR-557を選択しその生理活性を調べた。これらmiRNAは脂質代謝やステロイドホルモン合成に関与することが明らかとなった。次に、PCR可能なmiR-7877-5pとmiR-557の発現量をqPCR（デジタルPCR）にてAIH患者18例、正常者10例の血清を用いて検討した。現時点は発現量に有意差が認められていないため、症例数を増やし解析中である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

2019年度計画であるAIH患者血清からのエクソソーム抽出、健常者に比し発現上昇のあるエクソソーム由来のmiRNA候補を網羅的解析から3候補選択できており、現在、その発現量について特異性を確認するために多数例のAIH患者と健常者との比較を行っている。

Strategy for Future Research Activity

今年度は、miR-7877-5pとmiR-557の発現量をqPCR（デジタルPCR）にて、AIH患者、原発性胆汁性胆管炎患者と正常者の血清を用いてさらに解析を進める。有意差が得られた時点で、抽出・精製されたエクソソーム・miRNAを末梢血単核球、培養細胞（正常ヒト肝細胞、肝類洞内皮細胞）へ添加し影響を解析する。末梢血単核球では炎症性サイトカイン（IFN-α、TNF-α、IL-1β、IL-6等）およびToll-like receptors(TLRs)リガンドによるサイトカイン産生抑制効果をBio-Plexマルチプレックスアッセイシステムにて測定する。培養細胞では補体分子（C3、C4、MBL、ficolin）をELISA法にて測定し、併せてアポトーシス誘導（Caspase3/7アッセイ、Cell death detection ELISA）、細胞増殖抑制能（MTTアッセイ、BrDUアッセイ）について検討する予定である。