2019 Fiscal Year Research-status Report
臨床検体の網羅的遺伝子解析による胃癌不均一性メカニズムの解明
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19K08448
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Research Institution | Yokohama City University |
Principal Investigator |
芝田 渉 横浜市立大学, 医学研究科, 客員准教授 (00435819)
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Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
金子 裕明 横浜市立大学, 医学部, 助教 (20760078)
前田 愼 横浜市立大学, 医学研究科, 教授 (40415956)
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Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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Keywords | 胃癌 / 不均一性 |
Outline of Annual Research Achievements |
胃癌の進行と癌の組織学的不均一性には大きな関連があることが推測され、獲得メカニズムを明らかにすることは、胃癌進展を抑制する対策となりうる。胃癌における不均一性とは分化型胃癌において未分化型成分が混在してくると仮説を立て、検証を行う。 1.早期胃癌内視鏡切除検体における臨床病理学的検討:当教室で早期胃癌に対し内視鏡的粘膜下剥離術(ESD)を施行した症例について、純粋分化型癌、純粋未分化型癌および分化型に未分化型が混在する癌(混在癌)に分け検討した。2011例において、純粋分化型が1863例、純粋未分化型が56例、混在型が92例だった。混在型の特徴を分化型と比較すると、年齢、性別に差はなかったが、腫瘍径はやや大きく(16.1mm vs 24.4mm)、SM浸潤癌が多かった(12.2% vs 45.7%)。また、治療成績として、治癒切除率が低かった(90.5% vs 38.0%)。 2.オルガノイド細胞バンクの構築:患者固有の遺伝子変異やタンパク発現変化を効率よく網羅的に解析するため、生きた腫瘍細胞バンクを構築している。ま分化型癌、未分化癌、混在癌と考えられる腫瘍検体よりオルガノイド培養を行い、これまでに7例のオルガノイド培養に成功している。 3.遺伝子変異解析:高分化型腺癌15例のFFPE検体を用いて、DNAを抽出し、10遺伝子(TP53,ARID1A,CDH1,PIK3CA,RHOA,KRAS,TGFBR2,APC,CTNNB1,SMAD4)についてのNGS解析,及びCINパターンの進行胃癌において高頻度のコピーナンバー変化が報告されている11遺伝子(EGFR,ERBB2,など)についてのコピーナンバー解析を実施した。TP53の変異を15症例中10例(66.6%)と高頻度に認めた。コピーナンバー解析ではERBB2の増幅を15症例中3例、METの増幅を1例に認めた。
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Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
臨床的な解析は順調に進んでいる。さらに微小環境における細胞浸潤について幾つかの細胞マーカー(CD3,CD20, CD45, a-SMAなど)による免疫染色にて、炎症、繊維化の解析や既知の癌幹細胞化についてマーカーであるCD44, CD133, EPCAM, Nanogなどの発現変化の検討を行えていない。また、オルガノイド細胞バンクの構築がやや遅延している。
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Strategy for Future Research Activity |
レイザーマイクロダイセクション(LMD)を用いて、腫瘍部、正常部よりサンプルを抽出する。採取したサンプルよりDNAを抽出し、whole exonシーケンスまたは胃癌パネル(作成済み)を用いてシークエンス解析を施行する。同時に遺伝子コピー数解析により増幅、欠失の検討やメチル化アレイなどによる網羅的メチル化解析も行う。この解析によって、分化型癌と未分化型癌の共通点と相違点を同定する。腫瘍の分化度を規定する分化から未分化型への変化には微小環境が深く関わっていることが予測されるが、マイクロダイセクションした組織内でのRNAアレイ解析を行い、微小環境における変化を同定する。特に分化型癌と未分化混在癌の違いを検討し、腫瘍微小環境におけるサイトカインや増殖因子など幹細胞の維持や分化誘導に関与する因子を解析、同定する。作成したオルガノイド細胞を増殖させたのちに免疫不全マウス(ヌードマウスやNOGマウス)の皮下に移植し、腫瘍の増殖を観察する。増殖した皮下腫瘍について、臨床病理像との組織像を比較検討するが、分化型、未分化型癌が単独で存在する場合は同様の腫瘍組織像が得られると想定されるが、混在癌については、オルガノイドによって異なった組織像が得られる可能性が高いと考えている。この場合は混在癌の分化度は生体内での遺伝子変異や遺伝子修飾により不可逆的な変化に決定されていると考える。一方で、未分化型成分が観察されない可能性もあるが、その場合は腫瘍周囲のいわゆる腫瘍微小環境により未分化型形質の維持や未分化癌への一時的(可逆的)に変化をきたしている可能性を表す。これらのオルガノイド細胞は後述する分化型から未分化型への転換するメカニズム解析や胃癌不均一性の機序解明に用いる。
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Causes of Carryover |
やや研究が遅延しているため。次年度はオルガノイド培養、動物実験に使用予定である。
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