2021 Fiscal Year Research-status Report

自己免疫性膵炎の病態形成における腸内細菌の役割

Research Project

Project/Area Number	19K08468
Research Institution	Kobe University
Principal Investigator	井上潤神戸大学, 医学部附属病院, 助教 (50631561)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	酒井新神戸大学, 医学部附属病院, 特定助教 (50792636) 児玉裕三神戸大学, 医学研究科, 教授 (80378687)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2023-03-31
Keywords	自己免疫性膵炎 / 腸内細菌
Outline of Annual Research Achievements	自己免疫性膵炎（AIP）は血清IgG4高値とIgG4陽性形質細胞の浸潤を特徴とする機序不明の膵炎で、わが国で報告され現在IgG4関連疾患の一つとして難病指定されている。ステロイドの反応性から自己免疫的機序によるものと推察されているが、特異的治療がなく再燃率も高く問題となっている。申請者のグループは腸内細菌に対する抗体などの免疫反応が膵臓の炎症を惹起し疾患発症に関与しているのではないかという仮説を立案し研究を行っている。これまでに、AIP患者の腸管において分泌されている免疫グロブリンの組成が健常者と異なることを明らかとした。腸管に分泌される免疫グロブリンの各種アイソタイプと結合する菌をMACSおよびFACAにより分離し次世代シーケンサーにより菌の構成を解析した。AIP患者の免疫ブロブリンIgG4と結合している菌を解析し、AIPの腸管免疫に特異的に関わっている可能性のある菌の候補の絞り込みを行い、4菌種が抽出され、今後、それらの菌がどのようにAIPの病態に関わっているか、また腸内細菌が疾患マーカーになりうるかを解析する。さらに、AIP患者が腸管内容物の抗原に対して特異的に反応しているものをWestern blot法および質量分析法でタンパクのアミノ酸配列の同定を行った。解析したタンパクの中で細菌由来のタンパクの同定には至っていないが、AIP患者の血清の免疫グロブリンは便中のヒト膵臓由来のあるタンパクとの強く結合していることを見出した。今後、AIP患者の血清中免疫グロブリンと反応するタンパクの同定の条件検討を進め、免疫沈降法などを用いて特異的なタンパクの濃縮方法など条件検討を試みる。AIP患者の免疫グロブリンと結合する腸内細菌をMACS法およびFACS法で分離後の次世代シーケンサーによる菌叢解析の条件検討も行う。引き続きAIPに特異的な自己抗体候補の検索を行っていく。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 前年度までにAIP患者の血清中免疫グロブリンと反応する腸内細菌のタンパクを同定する目的で、採取した糞便中の腸内細菌を精製しタンパクを抽出したのち、western blotting法によってAIP患者の血清中免疫グロブリンと反応するバンドを確認した。さらに、質量分析装置を用いて、AIP患者の血清中免疫グロブリンと反応するバンド中のタンパクを解析した。解析したタンパクの中で細菌由来のタンパクの同定には至らなかったが、AIP患者の血清の免疫グロブリンは便中のヒト膵臓由来のあるタンパクとの強く結合していることを明らかとした。今後条件検討を行いIgG4と結合する細菌由来タンパクの同定を試みる。また、AIP患者の免疫グロブリンと結合する腸内細菌を分離し、DNA抽出を行った後に次世代シーケンサーによる16Sメタゲノムによる菌叢解析を行った。AIP患者の腸管IgG4と結合している菌叢で、その比率が多い上位20菌種の中で、健常者と比較し2倍以上の割合で、かつ、IgG4との結合親和性を表すICIスコアが０以上のものを抽出すると、unkonwn Blautia、Haemophilus parainfluenzae、unkonwn Streptococcus、Veillonella disparの4菌種が抽出された。今後、AIP患者の症例数を増やし再現性があるかの確認し、どのようにAIPの病態に関わっているか、また腸内細菌が疾患マーカーになりうるかを解析する。新型コロナの感染拡大に伴う学内の研究制限などによる影響で研究を一年延長行った。
Strategy for Future Research Activity	AIP患者の血清中免疫グロブリンと反応する腸内細菌のタンパクの同定は、免疫沈降法などを用いて特異的なタンパクの濃縮方法など条件検討を試みる。質量分析装置でタンパクの同定を行う。さらにAIP患者の免疫グロブリンと結合する腸内細菌をMACS法およびFACS法で分離後の次世代シーケンサーによる菌叢解析は、今後、再現性を確認する。AIPに特異的な自己抗体候補が明らかとなった場合in vivoによる免疫反応の確認を行う。
Causes of Carryover	新型コロナの感染拡大に伴う学内の研究制限などによる影響で研究を一年延長行った。今後は引き続き研究を継続し、物品、外注検査、成果発表などの使用を見込む。