NSAIDs起因性小腸傷害における好中球細胞外トラップの役割と診断・治療法確立

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K08474
• Research Institution: Osaka City University
• Principal Investigator: 渡邉 俊雄 大阪市立大学, 大学院医学研究科, 准教授 (50336773)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 灘谷 祐二 大阪市立大学, 大学院医学研究科, 講師 (00634007) ; 大谷 恒史 大阪市立大学, 大学院医学研究科, 講師 (30597555) ; 谷川 徹也 大阪市立大学, 大学院医学研究科, 客員准教授 (70423879)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: NSAIDs / 小腸傷害 / 好中球細胞外トラップ / シトルリン化ヒストン

Outline of Annual Research Achievements

令和元年度の検討において、インドメタシン起因性小腸傷害は好中球依存的であること、蛍光2重免疫染色法を用いて本傷害において好中球細胞外トラップ((neutrophil extracellular traps: NETs）が形成されていることを確認した。これらの結果を踏まえて、令和２年度は以下の検討えお行った。
1)NETs発現動態をウエスタンブロッティング法で検討した。NETsは抗シトルリン化ヒストンH3 (Cit-H3)を含む細胞外DNA成分として同定されるため、抗Cit-H3抗体を用いた。インドメタシン投与3、6、12、24時間後に屠殺して採取した小腸組織において、6時間をピークにNETsの発現が亢進していることが判明した。
2) 次に本傷害におけるNETsの役割解析を行った。PAD4阻害薬であるCl-amidineおよびStreptonigrinを投与しNETs抑制することにより、本傷害がCl-amidine投与群で27％、streptonigrin投与群で52％軽減することを確認した。これらの結果より本傷害においてNETs形成が傷害促進的の働いている可能性が示唆された。
3) さらに、Jackson labからB6.Cg-Padi4<tml.Kmow>/Jの凍結胚を購入、輸入し、チャールスリバージャパンで体外受精法による個体復元、検疫中である。今後はPAD4ノックアウトマウスを用いて本傷害におけるNETsの機能解析を行っていく予定である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

臨床症例の集積については予定よりも遅れているが、基礎研究については比較的順調に進んでいる。

Strategy for Future Research Activity

令和3年度は以下の検討を行う予定である。
1) 個体復元、検疫後のB6.Cg-Padi4<tml.Kmow>/Jを動物舎に搬入し、ノックアウトマウスを用いた本傷害におけるNETsの機能解析を行う。
２）NETs形成の抑制が、傷害の程度だけでなく、炎症性サイトカインやNLRP3インフラマソームの発現や活性化に及ぼす影響を検討する。
３）NETs形成は様々なNETs成分の血中への遊離を伴う。この中で、NETsに特異性が高い分子としてcell-free DNA、Cit-H3ならびにMPO-DNA複合体を傷害惹起後のマウス検体を用いてELISA法により測定する。
４）NSAIDs服用関節リウマチ患者の血中抗シトルリン化蛋白（抗CCP）抗体の有無（または抗体価）と、カプセル内視鏡で評価した小腸傷害重症度との相関を検討するために症例を蓄積する。

Causes of Carryover

新型コロナウイルス感染症流行により研究が当初の予定よりも遅れ、予定していた試薬を購入しなかったため。令和3年度はこれらの購入する予定である。