B型肝炎ウイルスのコア領域の変異がウイルスのライフサイクルに与える影響の解析

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K08482
• Research Institution: National Institute of Infectious Diseases
• Principal Investigator: 加藤 孝宣 国立感染症研究所, ウイルス第二部, 室長 (20333370)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: B型慢性肝炎 / 臨床的治癒 / 遺伝子変異 / cccDNA

Outline of Annual Research Achievements

現在のB型慢性肝炎の治療では主に核酸アナログ製剤が用いられている。しかし、この治療法ではHBV感染細胞内のcccDNAの排除は期待できず、肝炎の沈静化とHBs抗原の陰性化を目指した臨床的治癒が治療目標となっている。しかし、中には治療介入を行わずに肝炎が鎮静化する症例があり、どのような症例が薬剤を投与せずに臨床的治癒に至るかを見極める必要がある。近年、HBVのコア領域97番目のアミノ酸のイソロイシンからロイシンへの変異（I97L）を持つ患者では、HBs抗原やHBV DNA量が低下し、肝炎が鎮静化する症例が多いことが報告された。そこで、本研究では培養細胞でのHBV感染系を用いて、このアミノ酸変異がHBVのライフサイクルに与える影響を検討した。その結果、このI97Lの変異を持つHBV株では、HBV蛋白質およびウイルス粒子は通常のHBVと同様に産生されるが、粒子内のHBVゲノムである不完全二本鎖DNAの合成効率が低下し、主に一本鎖DNAをゲノムとして持つ未成熟なウイルス粒子が産生されることが明らかとなった。この未成熟なHBV粒子は通常のHBVと比較して感染力が低下しており、ウイルスの増殖能が損なわれていると考えられた。これは臨床的に観察されたI97L変異株感染者でHBs抗原やHBV DNA量の低下が期待できるという事象と一致しており、このI97L変異株の感染患者で見られる肝炎の鎮静化を説明できる結果と考えられた。今後はさらに検討を進め、I97L変異が関与する低い感染力が、HBVの肝細胞への感染のどの過程に依存しているかについて解析を行う。さらにこのI97L変異がHBV感染後のcccDNAの合成やその維持に与える影響についても検討を行う予定である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本年度は、コア領域のI97Lの変異がHBVの感染に与える影響について検討を行った。まず、HBVゲノムの1.38倍長を持つ複製モデルコンストラクトを用い、I97Lの変異がHBVのウイルス蛋白の発現と感染性ウイルス粒子産生に与える影響の評価を行った。その結果、I97L変異株では、複製モデルコンストラクトを培養細胞に導入した時のHBs抗原やコア関連抗原の発現には差を認めなかったが、産生されたウイルス粒子のNTCP-HepG2細胞への感染力が低下していることが明らかになった。さらにHBVの感染力価の定量が可能なHBVレポーターウイルスを用いて検討を行ったところ、このI97L変異の導入によりHBVレポーターウイルスの感染力価が約1/3程度にまで低下することが明らかとなった。
そこで、イオジキサノールを用いた密度勾配超遠心法によりI97L変異を持つHBV粒子の分析を行なった。イオジキサノールの密度勾配のプロファイルにおいて、通常のHBV株ではHBs抗原のピークの高密度側に感染力価のピークが存在し、さらに高密度の画分にコア関連抗原のピークが存在する。I97L変異株の密度勾配プロファイルでも、ほぼ同様のプロファイルを示し、HBs抗原やコア関連抗原のピークの分布に差を認めなかった。HBVの感染力価についてもピーク画分の位置は変化しなかったが、その感染力価が低下していることが明らかとなった。そこで、この感染力価のピークに存在するウイルス粒子に内包されているHBVゲノムについてサザンブロットで検出し、通常のHBV株とI97L変異株で比較を行った。その結果、通常のHBV株のウイルス粒子には不完全二本鎖DNAが多く含まれていたが、I97L変異株のウイルス粒子には未成熟な一本鎖DNAが主に含まれており、この感染性ウイルス粒子に含まれるゲノムの違いがI97L変異株の感染力価低下の原因と考えられた。

Strategy for Future Research Activity

本年度の研究成果から、コア領域のI97Lの変異はウイルス粒子内のHBVゲノムの合成に影響を与え、I97L変異株では未成熟な一本鎖DNAのゲノムを持つウイルス粒子が産生されることで感染力が低下し、増殖能が損なわれていることが明らかとなった。しかし、この変異株の低い感染力がHBV感染のどの過程に依存しているかは明らかではない。そこで、HBVの感染過程を、細胞への吸着・侵入・cccDNA合成に分けて検討を行い、I97Lの変異が与える影響を解析する。さらにcccDNAが合成された後の新規ウイルス粒子産生にI97Lが与える影響についても、pregenomic RNAの合成・カプシド産生・カプシド内のHBV DNA合成の各過程に分けて検討を行う。また、HBc抗原は二量体を形成し、その二量体がHBVのpregenomic RNAとポリメラーゼ蛋白質を包み込むことによりウイルスのカプシドが形成される。さらにカプシド内で不完全二本鎖DNAのゲノムが合成された後に、カプシドを形成するHBc抗原がlarge-HBs抗原と結合することでエンベロープが形成され、感染性ウイルス粒子が産生されることが知られている。そこで、I97L変異により未成熟なウイルスゲノム産生が起こる機序の解明のため、二量体形成に関わるHBc抗原間の直接的な結合や、カプシドとエンベロープの結合性に関わるHBc蛋白質とlarge-HBs抗原の結合について、I97L変異が与える影響をSplit-luciferase Assay Systemを用いて検討する。さらに、カプシド形成にはHBc抗原とpregenomic RNAとの結合も不可欠であり、HBc抗原とpregenomic RNAの親和性も関与している。そこでpregenomic RNAとHBc抗原の結合能にI97L変異が与える影響も免疫沈降法で評価する。

Causes of Carryover

年度末納品等にかかる支払いが平成31年4月1日以降となったため。当該支出分については次年度の実支出額に計上予定であるが、平成30年度分についてはほぼ使用済みである。