2019 Fiscal Year Research-status Report
The contribution of extracellular nucleotides and vesicles to the progression of atrial fibrillation
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19K08536
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| Research Institution | Tokyo Medical and Dental University |
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Principal Investigator |
笹野 哲郎 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 教授 (00466898)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 心房細動 / 細胞外核酸 / 細胞外小胞 / cell-free DNA / ミトコンドリア / バイオマーカー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
心房細動と全身性合併症の関連を解明するため、血中cell free DNA(cfDNA)に着目して解析を行った。マウス心房筋細胞の細胞株であるHL-1細胞に対して高頻度電気刺激すると、培地中陰cfDNAが放出され、得られたcfDNAをマクロファージに加えるとIL-1βおよびIL-6の発現が誘導された。cfDNAを核由来・ミトコンドリア由来に分けて評価すると、炎症性サイトカインの発現誘導はミトコンドリア由来cfDNAのみで生じており、マクロファージ内のTLR9が非メチル化cfDNAであるミトコンドリア由来cfDNAを認識していることが明らかとなった。臨床検体においも、心房細動患者の末梢血では総cfDNAおよびミトコンドリア由来cfDNAが有意に上昇していた。以上より、従来メカニズムが不明であった、心房細動に合併する慢性炎症の機序の一端を明らかにした。
また、心房細動における細胞外小胞の解明を進め、心房細動患者では末梢血中の細胞外小胞が増加していることを明らかにした。心房細動患者では比較的粒子径の大きな細胞外小胞が増えており、特異的な表面マーカーの候補を発見したことから、心房細動における疾患特異的細胞外小胞という概念を確立しつつある。さらに、超遠心などを必要としていた従来の細胞外小胞の抽出および評価系に対して、レーザー回折・散乱法を用いたより簡便かつ再現性の高い評価法を開発し、今後の研究における重要な基礎技術を確立した。
今後は、cfDNAについてより多数例での評価を行って心房細動の発症予測・進展予測のバイオマーカーとしての臨床的有用性の確立を目指す。また、細胞外小胞については疾患特異的細胞外小胞のプロファイルを明らかにし、細胞間コミュニケーションのメカニズムについてのさらなる検討を進めていく。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
1) 心房細動においてcell-free DNA (cfDNA)が炎症を起こすメカニズムの解明
マウス心房筋細胞であるHL-1細胞に対して高頻度電気刺激を加えると培地中にcfDNAが放出され、このcfDNAをマクロファージに加えるとIL-1βおよびIL-6の発現が誘導された。cfDNAを核由来・ミトコンドリア由来に分けて評価すると、炎症性サイトカインの発現誘導はミトコンドリア由来cfDNAのみで生じていた。ミトコンドリア由来cfDNAは核由来cfDNAと異なり、DNAメチル化を殆ど受けておらず、この非メチル化cfDNAがマクロファージ中のTLR9を介して炎症性サイトカインの発現を誘導していた。麻酔下のマウスにて右心房を高頻度刺激すると、血中のミトコンドリア由来cfDNAが上昇していた。さらに、心房細動患者の末梢血では健常者に比してcfDNAおよびミトコンドリア由来cfDNAが有意に上昇していた。
心房細動患者および健常者の末梢血よりcfDNAを抽出して比較定量すると、心房細動患者ではcfDNAレベルが有意に高く、特に持続性心房細動患者でcfDNAレベルが高かった。定量的PCRによりcfDNAを細胞核由来cfDNAおよびミトコンドリア由来cfDNAに分けてそれぞれ定量したところ、心房細動患者で主に増加しているのはミトコンドリア由来cfDNAであった。
2) 心房細動における細胞外小胞の放出とその病態生理学的意義
心房細動では、病態特異的な細胞外小胞が放出されて他細胞・他臓器へ影響を及ぼしているという仮説を立て、心房細動患者の末梢血より細胞外小胞を抽出してフローサイトメトリーで評価した。健常者に比べ、心房細動患者では径の大きな小胞が多く認められ、表面マーカー発現にも違いが見られた。また同時に、レーザー回折・散乱法による細胞外小胞の評価法の確立を試み、再現性の高い定量評価法を確立した。
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| Strategy for Future Research Activity |
1) 心房細動のバイオマーカーとしてのcell-free DNAの臨床的有用性の検討
血中cell-free DNA (cfDNA)およびミトコンドリア由来cfDNA (mt-cfDNA)について、より多数例での検討を重ねており、心房細動の発症予測および進展予測のバイオマーカーとしての有用性を評価する段階にある。また、mt-cfDNAの放出経路に関しての検討も重ねて行い、治療ターゲットとしてのcfDNA放出抑制についても検討する。
2) 心房細動における病態特異的細胞外小胞のプロファイル分析
心房細動においてcell-free DNAがどのように全身炎症を惹起するのか、さらにメカニズムを明らかにする。特に、脂肪細胞または血管内皮細胞と心筋細胞の相互作用における細胞外小胞の役割について、今回確立したレーザー回折・散乱法による定量とフローサイトメトリーによる質的評価、さらに単離した細胞外小胞中のタンパクの質量分析をそれぞれ行い、疾患特異的細胞外小胞のプロファイル分析の確立を目指す。
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| Causes of Carryover |
前年度より繰り越した基盤研究(C) 「生活習慣病における心房細動発症メカニズムの解明と発症予測」の資金を用いて研究を進められたこと、次年度により多数例での臨床検体を用いた検討を行うことを計画したために予算の繰越しを行い、次年度使用額を増額することとした。
また、細胞外小胞についてもその評価法を確立したが、次年度に多くの臨床検体を用いた有用性の評価を行う予定にしており、抽出試薬等が必要となるために、次年度使用を計画している。
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