ネクロプトーシスシグナル異常を標的とした心不全治療の開発

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K08544
• Research Institution: Sapporo Medical University
• Principal Investigator: 矢野 俊之 札幌医科大学, 医学部, 講師 (40444913)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 丹野 雅也 札幌医科大学, 医学部, 准教授 (00398322) ; 久野 篤史 札幌医科大学, 医学部, 准教授 (30468079)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 心不全 / ネクローシス / ネクロプトーシス / 心筋細胞 / mTOR

Outline of Annual Research Achievements

MLKL細胞内局在の変化がネクロプトーシスに与える影響の検討
生後3日齢のラット心室から単離した初代心筋細胞とH9c2心筋芽細胞を用いてネクロプトーシス誘導刺激がMLKLの細胞内局在に与える影響を検討した。ネクロプトーシス誘導刺激として、TNF (50 ng/ml)とカスパーゼ抑制薬(z-VAD-fmk: zVAD, 20uM)の同時投与(TNF/zVAD)を用いた。ネクロプトーシスの指標として、培養液中のLDH活性と細胞溶解液におけるRIP1とRIP3の結合レベル及びMLKLのリン酸化を用いた。TNF/zVAD投与12時間後に有意なLDH増加が認められ、MLKL siRNAを用いたMLKL発現抑制により遮断された。TNF/zVAD投与前の時点では心筋細胞核分画にMLKLはわずかに検出されるのみであったが、TNF/zVAD投与6時間後に有意に増加した。MLKLのネクロプトーシスによる細胞死に先行した核移行は、ネクロプトーシスシグナル解析において代表的な細胞の一つであるヒト結腸腺癌細胞であるHT-29細胞においても観察された。

心不全動物モデルにおけるネクロプトーシスの役割
拡張型心筋症マウスモデルとしてδサルコグリカン欠損マウスを用いた。左室駆出率が低下した時期に心筋組織を採取した。免疫組織化学染色にてリン酸化MLKLの発現部位を同定するとともに定量的に解析した。δサルコグリカン欠損マウスの左室心筋では、対象であるWTマウスの左室心筋と比較してリン酸化MLKLの発現が増加していた。さらに前年度に拡張型心筋症57例の解析で得られた結果と同様に、心筋細胞の細胞質、介在板および核にリン酸化MLKLの発現亢進が認められ、定量的解析では核リン酸化MLKLの発現がδサルコグリカン欠損マウスで有意に増加していた。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

この二年間の研究で、心筋細胞においてネクロプトーシス誘導刺激がMLKL核移行を誘導すること、拡張型心筋症動物モデルそしてヒト拡張型心筋症において核のリン酸化MLKL発現増加は心機能低下や不良な予後と関連することが明らかとなった。
一方、コロナ禍の影響で前年計画した詳細な解析までは期間内に終えることができなかった。

Strategy for Future Research Activity

1. ネクロプトーシスにおけるMLKL核移行の意義
TNF/zVAD刺激によるネクロプトーシスシグナル誘導がリン酸化MLKL(Ser368)の細胞内局在に与える影響を免疫染色もしくは過剰発現系を用いて解析する。in silico解析によりMLKLの核移行・排出を同定済みであり、MLKLの核移行シグナル阻害による細胞質型MLKL過剰発現および核外輸送シグナル阻害による核型MLKL過剰発現系を作成し、ネクロプトーシスとの関連を解析する。核型MLKL過剰発現系における遺伝子発現の変化をDNAアレイを用いて解析する。

2. 心不全動物モデルにおけるネクロプトーシスの役割
前年度の研究で核リン酸化MLKL発現亢進が明らかとなったδサルコグリカン欠損マウスを拡張型心筋症マウスモデルとして用いる。心エコーとコンダクタンスカテーテルで評価した左室形態及び左室機能を指標に代償期心不全と左室機能が低下した非代償期心不全の週齢を明確にする。in vivoにおけるネクロプトーシスの指標としてリン酸化MLKLとC9の免疫染色を用いる。心不全代償期と非代償期におけるリン酸化MLKLの細胞内局在、C9で検出したネクローシス、さらに核型MLKLによる制御される心筋代謝物を解析し、心不全の非代償化とネクロプトーシスの関連を検討する。mTORC1阻害薬とネクロプトーシス阻害薬(necrostatin-1)を投与し、心不全改善効果と下流の標的分子の関連性を明確にする。

Causes of Carryover

コロナ禍における実験計画遅延と関連している、次年度に使用予定。

Research Products

• [Journal Article] Coexistence of amyloidosis and light chain deposition disease in the heart (2021)
  • Author(s): Sobue Yoshihiro、Takemura Genzou、Kawamura Shunji、Yano Toshiyuki、Kanamori Hiromitsu、Morimoto Shin-ichiro、Matsuo Hitoshi
  • Journal Title: Cardiovascular Pathology Volume: 51 Pages: 107315～107315
  • DOI: 10.1016/j.carpath.2020.107315
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Utility of the sarcopenia index for assessment of muscle mass and nutritional status in patients with chronic heart failure: Comparison with anthropometric parameters (2020)
  • Author(s): Abe K, Yano T, Katano S, Ohori K, Ishigo T, Moniwa N, Miura T.
  • Journal Title: Geriatr Gerontol Int Volume: 20 Pages: 388-389
  • DOI: 10.1111/ggi.13876
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Empagliflozin attenuates acute kidney injury after myocardial infarction in diabetic rats (2020)
  • Author(s): Kuno A, Kimura Y, Mizuno M, Oshima H, Sato T, Moniwa N, Tanaka M, Yano T, Tanno M, Miki T, Miura T.
  • Journal Title: Sci Rep Volume: 29 Pages: 7238
  • DOI: 10.1038/s41598-020-64380-y
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Hemodynamic Collapse After Influenza Vaccination: A Vaccine-Induced Fulminant Myocarditis? (2020)
  • Author(s): Nagano N, Yano T, Fujita Y, Koyama M, Hasegawa R, Nakata J, Nishikawa R, Murakami N, Fujito T, Mochizuki A, Kouzu H, Muranaka A, Kokubu N, Miura T.
  • Journal Title: Can J Cardiol Volume: 36 Pages: 1554.e5-1554.e7
  • DOI: 10.1016/j.cjca.2020.05.005
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Distinct intra-mitochondrial localizations of pro-survival kinases and regulation of their functions by DUSP5 and PHLPP-1 (2020)
  • Author(s): Ohwada W, Tanno M, Yano T, Ong SB, Abe K, Sato T, Kuno A, Miki T, Sugawara H, Igaki Y, Miura T.
  • Journal Title: Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis Volume: 1866 Pages: 165851
  • DOI: 10.1016/j.bbadis.2020.165851
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Overestimation of glomerular filtration rate by creatinine-based equation in heart failure patients is predicted by a novel scoring system (2020)
  • Author(s): Ishigo T, Katano S, Yano T, Kouzu H, Ohori K, Nakata H, Nonoyama M, Inoue T, Takamura Y, Nagaoka R, Kondo F, Nakano K, Takada R, Kitagawa M, Kimyo T, Miura T.
  • Journal Title: Geriatr Gerontol Int Volume: 20 Pages: 752-758
  • DOI: 10.1111/ggi.13959
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Cardiac Light Chain Deposition Disease Mimicking Immunoglobulin Light Chain Amyloidosis: Two Branches of the Same Tree (2020)
  • Author(s): Osanami A, Yano T, Takemura G, Ikeda H, Inyaku M, Toda Y, Kamiyama N, Sugawara H, Gocho Y, Fujito T, Nagano N, Takahashi S, Muranaka A, Tanaka M, Moniwa N, Murase K, Takada K, Kuroda H, Ogawa Y, Miura T
  • Journal Title: Circ Cardiovasc Imaging Volume: 13 Pages: e010478
  • DOI: 10.1161/CIRCIMAGING.120.010478
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Reply to the comments on "Utility of the sarcopenia index for assessment of muscle mass and nutritional status in patients with chronic heart failure: Comparison with anthropometric parameters" (2020)
  • Author(s): Abe K, Yano T, Katano S, Ohori K, Ishigo T, Kouzu H, Moniwa N, Miura T.
  • Journal Title: Geriatr Gerontol Int Volume: 20 Pages: 998-999
  • DOI: 10.1111/ggi.14001
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Clinical Risk Factors and Prognostic Impact of Osteoporosis in Patients With Chronic Heart Failure (2020)
  • Author(s): Katano S, Yano T, Tsukada T, Kouzu H, Honma S, Inoue T, Takamura Y, Nagaoka R, Ishigo T, Watanabe A, Ohori K, Koyama M, Nagano N, Fujito T, Nishikawa R, Takashima H, Hashimoto A, Katayose M, Miura T.
  • Journal Title: Circ J Volume: 84 Pages: 2224-2234
  • DOI: 10.1253/circj.CJ-20-0593
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Independent link between peripheral artery disease and muscle wasting in patients with heart failure (2020)
  • Author(s): Ohori K, Yano T, Katano S, Kouzu H, Inoue T, Takamura Y, Nagaoka R, Ishigo T, Koyama M, Nagano N, Fujito T, Nishikawa R, Miura T.
  • Journal Title: ESC Heart Fail (supported by 19K08544) Volume: 7 Pages: 3252-3256
  • DOI: 10.1002/ehf2.12951
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] Clinical determinants and prognostic impact of osteoporosis in patients with chronic heart failure (2020)
  • Author(s): Katano S., Yano T., Tsukada T., Kouzu H., Honma S., Inoue T., Takamura Y., Nagaoka R., Ohori K., Koyama M., Nagano N., Nishikawa R., Hashimoto A., Katayose M., Miura T.
  • Organizer: ESC congress 2020
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] In Addition to Malnutrition, Comorbidities and Pharmacological Agents are Independent Explanatory Variables for Skeletal Muscle Mass in Chronic Heart Failure (2020)
  • Author(s): Yano T, Katano S, Miura T
  • Organizer: 日本循環器学会年次学術集会
• [Presentation] Phosphorylated MLKL, an Executor of Necroptosis, Localized in the Nucleus and Intercalated Disc Plays Distinct Roles in Nonischemic Dilated Cardiomyopathy. (2020)
  • Author(s): Fujita Y, Yano T, Nagano N, Nishikawa R, Kamiyama N, Fujito T, Mochizuki A, Koyama M, Kouzu H, Muranaka A, Nagahara D, Tannno M, Miki T, Miura T.
  • Organizer: 日本循環器学会年次学術集会
• [Presentation] Accumulation of free iron, but not protein-bound iron, in mitochondria may contribute to development of doxorubicin-induced cardiomyopathy. (2020)
  • Author(s): Sato T, Kikuchi T, Yano T, Miki T, Tanno M, Kuno A, Kouzu H, Miura T.
  • Organizer: 日本循環器学会年次学術集会
• [Presentation] Clinical significance of fischer ratio in heart failure with reduced ejection fraction (2020)
  • Author(s): Takahashi R, Yano T, Kouzu H, Katano S, Inoue T, Takamura Y, Nishikawa R, Nagano N, Muranaka A, Miura T.
  • Organizer: 日本循環器学会年次学術集会
• [Presentation] 診断マルチモダリティーとしての心筋病理の使い方 (2020)
  • Author(s): 矢野俊之
  • Organizer: 日本心不全学会学術集会