心血管疾患関連遺伝子CSRPのヒト遺伝子変異による分子機能異常の解明

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K08556
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 中島 康弘 京都大学, 医学研究科, 特定講師 (20565585)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: ゲノム医学 / 遺伝子変異 / 分子生物学 / 動脈硬化

Outline of Annual Research Achievements

CSRPのヒト一塩基変異体の分子機能異常についてin vitroでの検討を行った。前研究で同定した分子機能異常をもつCSRP1ヒト一アミノ酸変異体の細胞機能への影響を検討し、変異体の過剰発現でコントロールに比べH9C2細胞の細胞数の減少を検出し、細胞機能に影響しうる変異であることが示された。また、Tagのない変異体においても同様の結果が得られた。このことから同変異体は、動脈硬化などの生体の病態生理においても何らかの機能異常を来す可能性が考えられ、疾患形成における遺伝的要因となる可能性が示唆された。また、CSRPの他のヒト一アミノ酸変異に関してもin vitroで分子機能異常を示すものをさらに追加同定した。データベース上には一アミノ酸変異は数多く検出があり、CSRP1、2では総アミノ酸数の約半数にあたる約100個のアミノ酸部位にrare variantが検出されていた。その全てに関しin silico解析による変異の影響評価を行ったところ、半数近くの変異で４つのアルゴリズムの過半数で有害の判定であり、前述の結果も含め、分子機能異常を来すrare variantは少なくはないことが示唆される。ノックアウトマウスのフェノタイプからはCSRP1の機能増強型、CSRP2の機能喪失型の変異は動脈狭窄性病変の悪化につながることが示唆されるが、in silico解析では現状分子機能への具体的影響についての情報は得られないため、一アミノ酸変異がどのような機能異常を来すかについてbiologicalなアッセイでの検討が必要である。H9C2細胞につづきマウスES細胞でもゲノム編集を用いたライン作製を試みたが、少なくとも複数の変異ラインの検討を行うには現状一塩基変異の作成効率は非常に低かった。このためレンチウイルスベクター系で蛍光蛋白により一塩基変異体の発現量をモニターできる系での検討を開始した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

一塩基変異がbiologicalなアッセイにおいてどのような機能異常を来すかを同定することが重要であるため、理想的にはゲノム上に一塩基変異を導入した内在性一塩基変異の系を用いたin vitro, in vivoの検討を行うことが重要であるため、ゲノム編集を用いたライン作製を複数の細胞ラインで複数回にわたって施行したが、現状では一塩基変異ラインの作製効率は非常に低く必要なラインは得られていない。ゲノムデータベースの検討から対象となるヒトCSRP変異の種類は非常に多く、多数の変異ラインにおいて機能異常を検討していく必要性があることを考え、代替としてレンチウイルスベクターで解析可能な系を開始し検討を始めている。このためやや遅れているとした。

Strategy for Future Research Activity

一アミノ酸変異の機能異常について、本研究のこれまでのin vitroでの検討をはじめ、in silico解析の結果からも、ヒトのrare variantの中に分子機能異常を持つものが多数潜在していることが示唆される。これらのうち有意な機能異常を来すものは病態形成における遺伝的要因となることが考えられ、その詳細を明らかにしていくことは重要である。このことから、多種の一アミノ酸変異体について、どのような機能異常を来すか、分子病態など疾患に関わるメカニズムも含めて、さらに検討を行う。

Causes of Carryover

一塩基変異の細胞ラインの作製に難航し、同細胞ラインを用いた解析やin vivoでの実験など保留されているものがあり、予定使用額から差額が生じた。
次年度、実験の進行に合わせ予定分の使用を行い、重要な解析に対しては必要に応じて重点的に使用する。

Research Products

• [Journal Article] Homeobox A4 suppresses vascular remodeling by repressing YAP/TEAD transcriptional activity. (2020)
  • Author(s): Kimura M, Horie T, Baba O, Ide Y, Tsuji S, Ruiz Rodriguez R, Watanabe T, Yamasaki T, Otani C, Xu S, Miyasaka Y, Nakashima Y, Kimura T, Ono K.
  • Journal Title: EMBO Reports Volume: 21 Pages: e48389
  • DOI: 10.15252/embr.201948389.
  • Peer Reviewed / Open Access