Analysis of airway mucociliary transport via Toll-like receptors pathway

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K08600
• Research Institution: Hamamatsu University School of Medicine
• Principal Investigator: 藤澤 朋幸 浜松医科大学, 医学部, 助教 (20402357)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 鈴木 哲朗 浜松医科大学, 医学部, 教授 (00250184) ; 須田 隆文 浜松医科大学, 医学部, 教授 (30291397)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 粘液線毛輸送系 / 線毛輸送能 / 線毛活性 / TLR3 / polyI:C

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、TLRリガンド刺激による気道における粘液線毛輸送系の促進機序を解明すべく、マウス気管組織培養系を用いてpolyI:C（TLR3リガンド）添加による線毛輸送能・線毛活性の変化を解析した。線毛輸送能については、組織培養液中に蛍光ビーズを添加してそれらの移動する距離と時間を蛍光顕微鏡とビデオカメラで計測して、流体移動速度を算出した。また、線毛活性については、色素標識した線毛先端の動きを高速ビデオカメラで撮影して専用画像ソフトでイメージング解析し、線毛打頻度（ciliary beat frequency: CBF），有効打速度，回復打速度，有効打と回復打の非対称性を算出した。
野生型マウスより採取した気管組織培養において、poly:C添加により、気道上皮の流体移動速度ならびにCBFは有意に増加した．その作用はpolyI:C添加5分後より確認された。また、polyI:C添加は、有効打速度，回復打速度を有意に増加させたが、有効打と回復打の非対称性には変化を与えなかった。
次に、polyI:Cによる流体移動速度・CBFの増加作用はTLR3依存的であるか検証するため、TLR3欠損マウスより採取した気管組織を用いて、polyI:C添加による線毛輸送能と線毛活性の変化を解析した。その結果、TLR3欠損マウスにおいて、polyI:C添加による流体移動速度・CBFの増加作用は消失した．またpolyI:C添加は、有効打速度，回復打速度に変化を与えなかった。以上より、polyI:Cによる線毛輸送能ならびに線毛活性の促進作用はTLR3依存的であることが実証された。
現在、TLR3により認識されるインフルエンザAウイルスをマウス気管上皮に感染させ、ウイルス感染による気道の線毛輸送能・線毛活性の促進作用につき解析をすすめている。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究は，TLR3を介した遺伝子発現非依存的な粘液線毛輸送系の促進機序を解明し，その結果により，粘液線毛輸送能を高める新規薬剤の開発に向けた基盤を作ること、を目的としている。
現在までの解析において、マウス気管の組織培養系と、蛍光顕微鏡・ビデオカメラ等を用いた画像イメージング解析法により、線毛輸送能の定量評価として流体移動速度を算出する解析方法、ならびに線毛活性の定量評価として線毛打頻度（CBF），有効打速度，回復打速度，有効打と回復打の非対称性を計測する解析方法を確立した。
これまでの実験では、上述の線毛輸送能・線毛運動の定量評価法を用いて、TLR3リガンドであるpolyI:Cは、添加後早期（5分後）より、線毛輸送能ならびに線毛活性を促進することを同定した。さらにTLR3欠損マウスより採取した気管の組織培養を用いて、polyI:Cによる線毛輸送能・線毛活性の促進作用はTLR3依存的な作用であることを実証した。
現在は、TLR3により認識されるウイルスをマウス気管上皮に感染させ、ウイルス感染が感染早期より気道の線毛輸送能・線毛活性を促進するかにつき解析をすすめている。実際には、気道感染を来すウイルスとしてインフルエンザAウイルスを組織培養液に添加し一定時間気管組織を培養し、インフルエンザAウイルス感染が線毛輸送能・線毛活性に与える作用を同様の実験系を用いて解析している。
さらに、今後はTLR３を介する線毛輸送能・線毛活性の促進作用に関わる細胞内メカニズムに関しても解析をすすめる予定である。

Strategy for Future Research Activity

2019年度の研究により、polyI:CはTLR3経路を介して気道上皮における線毛輸送能ならびに線毛活性を促進することを同定した．現在、気道感染を来すウイルスとしてインフルエンザAウイルスを培養液に添加し、一定時間マウス気管を組織培養する実験系を用いて、インフルエンザAウイルス感染が線毛輸送能・線毛活性に与える作用を解析している．
これまでの検討により、野生型マウスにおいて，インフルエンザAウイルス感染は、線毛輸送能・CBFを増加させることが確認された．今後は、インフルエンザAウイルスによる線毛輸送能・線毛活性の促進作用が、TLR3依存的であるか否か検証するため、TLR3欠損マウスの気管組織培養を用いて検証する予定である。インフルエンザAウイルスによる線毛輸送能・線毛活性の促進作用が、TLR3を介することが確認されれば、インフルエンザAウイルスによる線毛輸送系の促進機序とpolyI:Cによるそれは同様であると推測される。
線毛運動の促進機序として，細胞外に放出されたATPはP2受容体ファミリーで認識され線毛輸送系を促進することが知られている．そこで、TLR3を介する線毛輸送系の促進作用における細胞外ATP放出の関与を検証するため，polyI:C添加の有無による培養液中ATP濃度の変化を測定する．また、polyI:C添加によりATP濃度の上昇が確認されれば、polyI:CによるATP放出がTLR3を介する応答である検証するため、TLR3欠損マウスより採取した気管組織を用いて解析する予定である．
さらに、polyI:C　添加により細部外に放出されたATPがP2受容体を介して線毛輸送系の促進に寄与するか検証するため, P2受容体アンタゴニストを添加して線毛輸送能・線毛活性を解析し，polyI:Cによる粘液線毛輸送能の促進におけるATP-P2受容体経路の関与を検証する．

Causes of Carryover

2019年度は、比較的実験が順調に進み、当初の予定と比較してマウス飼育費等を抑えることができ、そのため次年度使用額が生じた。2020年度は、インフルエンザ Aウイルス感染実験、TLR3活性による線毛輸送系促進のメカニズム解析を主体に実施する計画である。2020年度には、野生型、TLR3ノックアウトマウスの飼育維持をはじめ、ウイルス実験関連の試薬・物品の購入、ATP測定関連試薬等に多くの研究費が必要となることが予想される。そのため、2019年度助成金も合わせて活用し、研究をすすめてゆく予定である．