エストロゲン欠乏によりヒト気道上皮細胞において発現変化をきたす遺伝子の網羅探索

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K08619
• Research Institution: 公益財団法人結核予防会 結核研究所
• Principal Investigator: 宮林 亜希子 公益財団法人結核予防会 結核研究所, 生体防御部 病理科, 研究員 (40834726)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 瀬戸 真太郎 公益財団法人結核予防会 結核研究所, 生体防御部 免疫科, 科長 (50383203) ; 慶長 直人 公益財団法人結核予防会 結核研究所, 副所長, 副所長 (80332386) ; 土方 美奈子 公益財団法人結核予防会 結核研究所, 生体防御部, 部長 (90332387)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 肺MAC症 / 気道上皮細胞 / エストロゲン

Outline of Annual Research Achievements

非結核抗酸菌(NTM:nontuberculous mycobacteria)感染によって起きるNTM症、特に肺MAC(Mycobacterium avium complex)症が近年増加している。肺に器質的障害を持たない痩身の中高年の女性例に多い気管支拡張型は、閉経後に発症する場合が多いことから、女性ホルモンの欠乏が病態に関連する可能性が考えられている。本研究は、女性由来のHPV-18 E6/E7による不死化ヒト気道上皮細胞株HBE1と我々が保有する手術検体由来のヒト初代培養気道上皮細胞パネルを用いて、エストロゲンの合成、代謝や作用に関わる遺伝子の遺伝型を考慮した上で、炎症状態の気道上皮細胞でのエストロゲンの有無による遺伝子発現の違いを網羅的mRNA発現解析により解析し、中高年女性の肺MACの病態に関わる遺伝子、パスウェイの候補を得ることを目的とする。
本年度は、HBE1細胞を用い、エストロゲン(17β-Estradiol)刺激により発現誘導されるmRNAの発現を検討した。通常培地に含まれるフェノールレッドがエストロゲン様作用を有するため、フェノールレッド不含有培地でのHBE1細胞の至適な培養条件を確立した。エストロゲン刺激前には、培地をさらにBPE（ウシ下垂体抽出液）不含有培地に交換し、エストロゲン刺激後24, 48, 72時間で細胞を回収した。RNAを抽出し、RT-qPCRを用いてエストロゲン刺激で誘導されることが報告されているmRNAの発現量を解析し、エストロゲン作用のマーカーとなる遺伝子発現を確認した。これらのデータを用い、mRNA発現網羅解析を行うエストロゲン濃度、作用時間等を決定した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

HBE1細胞培養条件を確立することに当初の予定より時間を要したため、本年度は、HBE1細胞を用い、炎症状態においてエストロゲン添加の有無により遺伝子発現量に有意な違いのある遺伝子の網羅探索mRNA-seqをする計画であったが、 mRNA-seqの実施にまで至らなかった。現在は培養条件も確立されている。

Strategy for Future Research Activity

条件検討の結果得られたHBE1細胞のエストロゲン刺激、炎症刺激の至適条件において、エストロゲン刺激の有無で発現量に有意な違いのある遺伝子をmRNA-Seqを用いて網羅探索する。さらにHBE1細胞で確立された条件に従い、炎症状態におけるエストロゲン添加の有無で、初代培養気道上皮細胞での遺伝子発現量の違いをmRNA-Seqを用いて探索する。

Causes of Carryover

次世代シークエンサーNextSeq 500を用いたmRNA網羅発現解析のためのシークエンスキットなどの遺伝子発現解析用試薬の購入を一部次年度に繰越し、２年度目にmRNA発現網羅解析を行う。