Development of methods to quantify the release of type C rhinovirus from airway epithelial cells obtained from patients with obstructive pulmonary diseases

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K08620
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 山谷 睦雄 東北大学, 医学系研究科, 教授 (60261640)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 西村 秀一 独立行政法人国立病院機構(仙台医療センター臨床研究部), その他部局等, 医長・室長 (50172698)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: C型ライノウイルス / PCR法 / ウイルス放出量定量化 / マクロライド / 炎症性サイトカイン / 気道上皮細胞

Outline of Annual Research Achievements

令和１年度に予定していた計画に沿って、以下の結果を得た。
１）C型ライノウイルス培養液定量法はフィルター膜に培養したヒト鼻腔粘膜上皮細胞の粘膜側洗浄液(airway surface liquid)に検出される細胞外ウイルスRNAおよび細胞内のウイルスRNAを測定することで実施した。その結果、C型ライノウイルスの細胞外放出量が時間経過によって増加し、感染後７２時間で最大になることを確認した。また、細胞外ウイルス放出量が細胞内のウイルス合成量と相関することを確認した。このことは、粘膜側洗浄液を用いたC型ライノウイルス細胞外RNAの測定が細胞内におけるウイルスの複製を反映していること、および、これまで行われてきた感受性細胞を用いた細胞変性効果によるウイルス放出量測定と同様に、ウイルス放出量を反映していることを示唆した。
２）マクロライドであるバフィロマイシン、クラリスロマイシンとEM900、エンドソームのpHを酸性化するNa+/H+ 交換チャネルの阻害薬である(Ethylisopropyl amiloride)によるC型ライノウイルスの細胞外放出量の低下を確認した。また、これらの薬剤によるヒト鼻腔粘膜上皮細胞の酸性エンドソームの減少を確認した。したがって、C型ライノウイルスの複製過程における酸性エンドソームの役割が明らかになった。また、逆に、酸性エンドソームを減少する薬剤であればC型ライノウイルスの複製を抑える可能性が示唆された。
３）炎症性物質であるインターロイキン（IL）-6およびIL-8のフィルターの外側（＝漿膜側）にある培養液中濃度がC型ライノウイルス感染後に上昇することを確認した。C型ライノウイルス感染によって気道炎症が惹起される機序に関係すると思われる。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

令和１年度に予定していた計画を概ね実行した。すわなち、１）C型ライノウイルス培養液定量法の検討、２）薬剤によるC型ライノウイルス増殖抑制の検討、は予定通りに実施できた。３）炎症性物質の培養液放出量増加の検討は、少ない症例数ではあるが確認した。すなわち、
１）C型ライノウイルス培養液定量法はフィルター膜に培養したヒト鼻腔粘膜上皮細胞の粘膜側洗浄液に含まれる細胞外放出量が時間経過によって増加し、細胞外ウイルス放出量と細胞内ウイルス合成量の時間経過が相関することを確認した。これまで行われてきた感受性細胞を用いた細胞変性効果によるウイルス放出量測定と同様に、ウイルス放出量を反映しており、粘膜側洗浄液に含まれる細胞外に放出されたRNA量測定によるC型ライノウイルス定量法として使用できることを示唆した。
２）バフィロマイシンなどのマクロライドによって酸性エンドソームを減少させることでウイルス放出量が減少した。このことはB型ライノウイルス（＝１４型ライノウイルス）と同様に、C型ライノウイルスの脱殻が酸性エンドソームを介しており、酸性エンドソームを介した経路がC型ライノウイルスの増殖経路の少なくとも一部を担っていることが明らかになった。
３）炎症性物質のうち、IL-6とIL-8の培養液放出量増加を確認した。症例数と炎症性物質の種類を今後増加する予定である。

Strategy for Future Research Activity

研究計画に沿って、以下の研究を促進する予定である。
1)感染受容体であるCDHR3の発現程度に対する薬剤の抑制効果を検討する。CDHR3の発現はmRNAを定量化する。２）気道炎症を惹起する物質をウイルス感染前後で測定する。IL-6、IL-8を中心に症例を増やして確定する。３）バフィロマイシンなどのマクロライドによる炎症惹起物質の放出抑制を検討する。４）気管支喘息の有無でC型ライノウイルスの放出量が増加するかどうか、感染受容体の発現が増加するかどうかを検討する。

Causes of Carryover

令和元年度の研究において計画通りの成果を得られたが、消耗品使用費が予定より少なかったため96,631円の次年度使用額が生じた。令和2年度において、進行中のサイトカイン測定および研究消耗品の購入に使用する予定である。