胸膜中皮腫の予後改善を目指した診断マーカーと阻害化合物の探索

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K08668
• Research Institution: Aichi Medical University
• Principal Investigator: 細川 好孝 愛知医科大学, 医学部, 教授 (60229193)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 太田 明伸 愛知医科大学, 医学部, 講師 (30438048)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 悪性胸膜中皮腫 / 癌抑制遺伝子 / 遺伝子編集技術 / cDNAマイクロアレイ

Outline of Annual Research Achievements

・悪性胸膜中皮腫はアスベスト曝露に関連して発症し、2000年から2039年までの40年間で患者の死亡者数は10万人を超えると予測されている。多くは進行した状態で診断され、化学療法や免疫チェックポイント阻害薬の併用療法が行われているが、その効果は極めて限定的である。悪性中皮腫では、癌抑制遺伝子であるp16INK4a ，NF2 ， BAP1に不活化変異が高頻度に検出される。本研究では、胸膜中皮細胞を用いて癌抑制遺伝子ノックアウト株を作成し、中皮腫の増殖・浸潤・転移に関わる細胞内分子および阻害化合物を同定し、新規診断マーカーや新規治療薬の候補分子を探索することを目的としている。将来的には中皮腫に対する効果的な診断法・治療法を開発することを目指している。
・我々は、cDNAマイクロアレイ網羅的発現解析とリアルタイムPCR解析によって、NF2ノックアウト株で高発現する遺伝子としてFGF受容体2を同定した。FGF受容体2抗体を用いた組織アレイ解析では、中皮腫23検体中で9検体が陽性を示し、FGF受容体2が診断バイオマーカーのための有望な候補であることが示された。
・次に、NF2/p16 ダブルノックアウト細胞株を樹立し、CD24遺伝子が特異的に高発現していることを見出した。CD24抗体を用いた組織アレイ解析では、中皮腫45検体中で34検体が陽性を示し、FGF受容体2と共にCD24が新たな診断バイオマーカーの候補であることが示された。さらに、ダブルノックアウト細胞株を用いて400個小分子化合物ライブラリーのスクリーニングを行い、脂肪酸合成酵素阻害剤が特異的な細胞増殖抑制効果を示すことを発見した。
・癌抑制遺伝子BAP1のノックアウト細胞株の樹立に成功した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

胸膜中皮細胞でNF2ノックアウト細胞株およびNF2/p16 ダブルノックアウト細胞株を樹立し、網羅的発現解析と免疫組織染色解析から胸膜悪性中皮種検体で高発現している分子を同定することに成功していることから、当初の実験計画をおおむね達成できているため。

Strategy for Future Research Activity

・愛知県がんセンター、近畿医科大学、兵庫医科大学の研究チームと連携し、中皮腫患者検体を用いたFGF受容体2 およびCD24による免疫組織染色の規模を拡大して実施する。中皮腫特異的な染色が確認できれば、次に患者血清や胸水を用いたELISA法及びCLEIA 法を確立し、新たな早期診断の開発を目指す
・400個の小分子化合物ライブラリーのスクリーニングを行い、NF2/p16 ダブルノックアウト細胞株で腫瘍特異的な細胞増殖抑制効果を示す脂肪酸合成酵素阻害剤を発見した。がん細胞では脂肪酸合成が亢進しており、脂肪酸合成の亢進ががん細胞の増殖に関与していることが明らかになってる。今回発見した脂肪酸合成酵素阻害剤による細胞増殖抑制効果の分子基盤を明らかにしていく。また、他の脂肪酸合成酵阻害剤でも効果を検討する。
・中皮腫で高頻度に不活化している癌抑制遺伝子BAP1のノックアウト株を準備し、MTTアッセイによる細胞増殖を指標として、まず400個小分子化合物ライブラリーを用いたスクリーニングを行う。将来的には、東京大学の創薬機構に所蔵される小分子化合物ライブリーの取得を申請し、約1～2万種類の化合物からシーズ探索を計画する。
・中皮腫の病態を細胞レベルから個体レベルで解析するため、樹立した細胞株を種々の免疫不全マウスに移植し、マウス造腫瘍能について検討する。癌抑制遺伝子ノックアウト株の移植に成功すれば、細胞レベルで確認された生物学的特性を個体レベルで検証することが可能となる。また、細胞レベルでスクリーニングされた化合物の効果を個体レベルで検討することも可能となる。

Causes of Carryover

遺伝子編集技術を用いた癌抑制遺伝子ノックアウト細胞株の樹立が当初の計画より早期に効率よく達成されたため、分子生物学実験にかかる物品費が低く抑えることができた。また、実験助手を採用する必要がなく、人件費も抑えることができたため。次年度使用額は、マウスを用いた移植実験に使用する計画である。

Research Products

• [Journal Article] Establishment and characterization of CRISPR/Cas9-mediated NF2-/- human mesothelial cell line: Molecular insight into fibroblast growth factor receptor 2 in malignant pleural mesothelioma. (2019)
  • Author(s): Wahiduzzaman M, Karnan S, Ota A, Hanamura I, Murakami H, Inoko A, Rahman ML, Hyodo T, Konishi H, Tsuzuki S, Hosokawa Y.
  • Journal Title: Cancer Science Volume: 110 Pages: 180-193
  • Peer Reviewed / Open Access