新規尿中バイオマーカートロンビンの腎疾患診断・治療における有用性の検討

2021 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 19K08681
• Research Institution: Kumamoto University
• Principal Investigator: 安達 政隆 熊本大学, 病院, 准教授 (90398206)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 向山 政志 熊本大学, 大学院生命科学研究部(医), 教授 (40270558)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 尿中トロンビン

Outline of Annual Research Achievements

1)腎生検を施行する種々の腎疾患患者から同意を得て尿検体の収集し、現在まで約200例分の尿を回収し、保存した。2021年度回収分の尿の一般尿生化学検査を提出し、現在、基本となる生化学データを収集中である。
2)2種類のトロンビン抗体含有腹水約700μLからトロンビン抗体をスピンカラムで精製後にトロンビン抗体量を測定した結果、それぞれ約3mgの抗体量の回収を確認した。さらにウエスタンブロットや銀染色を行い、トロンビン抗体の精製度についても確認した後、精製したトロンビン抗体をプレートに固相化し、新たにトロンビン測定用のELISAプレートを作製した。
3)作製したELISAプレート用いて尿中トロンビンのa)保存温度およびb)凍結融解における安定性について検討した。トロンビン陰性の検体尿にαトロンビンを添加し、4℃、10℃または37℃に1、2、3、5時間保温した後、αトロンビン濃度を測定した。さらに1、2，3回まで凍結融解したサンプルを同様に測定した。a)保存温度による尿中αトロンビン濃度の時系列変化の検討において、尿中αトロンビンは4℃、10℃、37℃の保存状態で5時間経過後も安定していると考えられ、ELISA法による測定結果に大きな影響は与えないと考えられた。b)凍結融解回数による尿中αトロンビン濃度の変化の検討において、尿中αトロンビンは3回までの凍結融解に対して安定していると考えられ、ELISA法による測定結果に大きな影響は与えないと考えられた。
4) 作製したELISAプレートを用いて腎生検を施行した種々の腎疾患患者から回収した約200例分の尿中トロンビン濃度を測定し、結果を解析中である。
5) 4)で測定した中で尿中トロンビン濃度が高値であった半月体形成性糸球体腎炎および糖尿病性腎症患者の腎生検組織標本を用いて糸球体における組織因子の免疫染色を施行し、結果を解析中である。