2020 Fiscal Year Research-status Report
虚血性急性腎不全におけるconnexin 43の役割の解明
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19K08684
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Research Institution | Tohoku Medical and Pharmaceutical University |
Principal Investigator |
衣笠 哲史 東北医科薬科大学, 医学部, 非常勤講師 (80796342)
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Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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Keywords | 腎虚血・再灌流障害 / 急性腎障害 / ギャップ結合 |
Outline of Annual Research Achievements |
当研究では急性腎障害や腎移植における後期移植腎機能障害など、腎臓内科領域において重要な臨床的病態に関わる主要な機序の一つである腎虚血再灌流障害(renal I/R)において、connexinの一つであるconnexin 43(Cx43)の果たす役割を解明することにより、急性腎障害や移植腎機能障害における新たな治療標的を見出し、有効な予防・治療戦略の開発を目指す。129/Sv野生型マウス(WT)とCx43ヘテロ接合体ノックアウトマウス(Cx43+/-)の腎に虚血・再灌流を施したところ、WTでは髄質外層外帯(OSOM)において腎虚血後24~48時間をピークとして大量の好中球浸潤が見られ、対照的に72時間後では髄質外層内帯(ISOM)を中心に高度のマクロファージ浸潤を認めた。腎ホモジネートのリアルタイム定量PCR法では、虚血後3時間の段階でCx43、HIF1α、galectin-3の発現増加が認められた。続いてMCP-1とKim-1が増加し、PCNAとVCAM1は遅いタイムポイントにおいて増加を認めた。免疫組織染色では近位尿細管のS3セグメントにCx43の染色を認めた。また、PCR法でNGAL,HIF1αとgalectin-3のmRNAの有意な減少を認めた。さらに、Cx43+/-マウスでは虚血後48時間でOSOMの好中球浸潤が80%と著明に減少しており、組織像の改善と、血中BUN・クレアチニン値の有意な低下を認めた。このように、我々はrenalI/RにおけるCx43の発現増加は種々のサイトカインや炎症性マーカーの発現量の変化との関連が認められ、Cx43+/-マウスにおいて腎機能と腎組織学的所見が改善することを発見し、本研究で更に詳細な検討を行っている。
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Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
前年度は目的の細胞を単離するための実験手法をmagnetic beads付き抗体と磁界を用いた手法からBD FACS Ariaセルソーターにより3種類の細胞を一つの実験で同時に単離する手法に切り替えた。この手法では一つの腎臓より3種類の細胞を同時に採取できるため、当初の予定よりも実験を迅速に進行し、進捗を早めることができた。本年度も引き続き同様の実験を継続しており、臨床業務など他の業務の合間に実験を行うという制約はあるものの概ね予定通りに研究を進めることができている。ただし、COVID-19によるパンデミックの影響と、臨床業務が予定よりも多くなった関係で、予定していた実験の一部を行うことができなかった。
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Strategy for Future Research Activity |
引き続き、BD FACS Ariaセルソーターを用いて複数の再灌流時間で作成したマウス腎虚血再灌流モデルを用い、腎臓の近位尿細管上皮細胞、血管内皮細胞、好中球の3種の細胞を採取してqPCR、免疫蛍光染色など各種の解析を行う。connexin 43の129X1/Svの系統を用いたヘテロ接合体ノックアウトマウスでは腎虚血再灌流障害の軽減が見られるという知見を既にフランスInserm-U1155における過去の実験で得ており、これらのマウスにおいても同様の実験を行い、発現遺伝子に差が見られるかどうかを検討する。また、単離したPTEC、内皮細胞の初代培養細胞を使用しIn vitro 低酸素実験モデルを用いて、GJC またはHC を介した細胞間コミュニケーションの阻害による影響を検証する実験も検討している。野生型マウスのPTEC または内皮細胞を単離し、初代細胞培養を行い、免疫蛍光法でConnexin 43 の存在を確認した後、得られた細胞を用いて低酸素実験を行い、GJC またはHC の阻害薬を投与し、定量PCR 法とウェスタンブロッティングにより様々な分子の発現を評価し、GJC/HC 阻害薬投与群と非投与群の表現型を比較する。当初解析予定であった以外の細胞を解析することも検討中である。
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Causes of Carryover |
新型コロナウイルス(COVID-19)によるパンデミックの影響で、一部の遺伝子に関しては予定通りにセルソーターを用いた各種細胞の単離と各種解析を実施することが叶わず、本年度の支出額が予定よりも減少した。令和3年度は、当初予定していた研究内容と合わせて本年度行うことができなかったこれらの実験に関しても実施する。次年度使用とした金額は未達の実験、即ちセルソーターを用いた各種細胞の単離と各種解析に係る経費として使用する予定である。
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