2019 Fiscal Year Research-status Report
Strategy of vascular protection by augmentation of endothelial glycocalyx
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19K08690
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| Research Institution | Showa University |
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Principal Investigator |
本田 一穂 昭和大学, 医学部, 教授 (10256505)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
康 徳東 昭和大学, 医学部, 助教 (00571952)
高木 孝士 昭和大学, 大学共同利用機関等の部局等, 講師 (10774820)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 血管内皮 / グリコキャリックス / レクチン / 糖鎖 / 低真空走査型電顕 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
令和1年度は，培養細胞を用いたin vitro実験系で，ヒト糸球体内皮細胞（HuGEC）のGCXの検出を検討した．複合糖鎖のNアセチルグルコサミン(GluNAc)やN-アセチルノイラミン(NeuNAc)の両者と結合する小麦胚芽アグルチニン（WGA）とNeuNAcのみを検出するセイヨウニワトコ（SNA）レクチンを用いて培養細胞表面を共焦点レーザー顕微鏡で観察し，一定の厚さを持つGCX層として評価できた．一方，内皮細胞の接着や透過性を制御している膜結合型蛋白のVE-カドヘリンや CD31(PECAM)はそれぞれの蛍光標識抗体で同様に描出され、共焦点レーザー顕微鏡でその局在とGCXの関連が観察された．次にコンフルエントの培養HuGECに、糸球体内皮傷害型の副作用が報告されている抗癌剤Gemcitabin（GEM）を0.5および1mMで2日間暴露させ，細胞形態，cell viability (MTT assay)，WGAとSNAの染色性ならびにVE-カドヘリンやCD31の発現を検討した．GEM刺激により光顕的に有意な形態変化は認められなかったが， 濃度依存性のviabilityの低下とSNAの染色性の低下を認めた．WGAの染色性には明らかな変化は見られなかった。mRNA発現の検討では，IL-1β，IL-6などのサイトカインやGCX分解に関与するMMP-9の発現が増加していた．In vivo実験モデルとしてSTZ投与による糖尿病マウスモデルを作成し，1%アルシアン青（ALB）含有固定液でホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）切片を作成し、PAM染色で銀増感させ、腎血管のGCXを光学および電子顕微鏡で検出した．DM群では光顕的にGCX描出に有意な変化はなかったが， 低真空走査型電顕（LVSEM）による３次元的GCX観察では，腎の血管内腔面に細顆粒状のALB粒子の分布に変化が見られた．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
培養内皮細胞を用いた実験系では，共焦点レーザー顕微鏡による内皮GCXの形態学的な定量評価の検討が遅れている．また，GCXの質的変化として２つのレクチンを用いてGCXの成分を検出できたが，定量的評価やその他の糖鎖や糖鎖修飾を受ける膜蛋白側の評価が不十分である．また、培養細胞の電子顕微鏡的形態評価を行うことが出来なかった．理由としては，主に研究者の時間的余裕が足りなかったことに由来するが，共焦点レーザー顕微鏡による観察に時間的制約があったことも関連している．
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| Strategy for Future Research Activity |
培養内皮を用いた研究では，GCXの量的のみならず，質的な変化について評価する必要がある．今後の方針として，正常状態や傷害ストレス状態（グルコース分解産物や内皮傷害型の薬剤による）の内皮細胞のGCX成分の評価（GluNAc，GalNAc，NeuNAcなどの比率），コア蛋白であるシンデカンやグリピカンの発現量，膜結合蛋白であうCD31やカドヘリンなどの分子の変化について，共焦点レーザー顕微鏡による形態的評価やmRNA発現による機能的評価を行う．また，傷害時に内皮細胞から放出あるいは分泌される分子については培養上清をウエスタンブロット法やELISA法で定量的に評価する．さらにGCXの合成や分解を調節する酵素系の評価を細胞分画のウエスタンブロット法やmRNA解析で行い，内皮GCXの量的あるいは質的な調節メカニズムを明らかにする．また，培養内皮細胞の超微形態変化を透過型および走査型電顕で観察し，内皮GCXと細胞小器官の変化の関係を検討したい．In vivoの実験モデルとしては，STZ投与による糖尿病マウスモデルをさらに詳しく検討し，腎の血管レベルに応じた内皮GCXの状態を，光顕・電顕レベルで検討する．さらに，これらのin vitroおよびin vivoの実験系の試料は，質量分析イメージングやラマン散乱光顕微鏡による新しい分子イメージング手法への応用を試みて，網羅的GCX成分解析法の確立を目指す．以上の検討結果を基に，本研究の目的である「傷害から内皮を保護するためのGCX強化療法の戦略」を考案する手がかりを得たいと考えている．
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| Causes of Carryover |
本年度は，GCX検出や糖鎖成分の解析，細胞培養関係の試薬などで，ほぼ予定どおりの金額を物品費として使用した．残額の2862円は次年度の物品費の補助に使用する予定である．
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