2020 Fiscal Year Research-status Report
ヒトiPS細胞に由来する尿管芽オルガノイドの拡大培養法の開発
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19K08703
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
前 伸一 京都大学, iPS細胞研究所, 特定拠点助教 (50749801)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | ヒトiPS細胞 / 尿管芽 / オルガノイド / 拡大培養 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
胎生期の腎前駆組織である尿管芽は分枝を繰り返すことにより形態形成を行う。尿管芽の分枝構造において、幹部（trunk）が集合管に分化し、先端（tip）では非対称分裂により自己複製もしくはtrunkに分化する2種類の細胞系譜を産生する。したがって、分枝形態形成の過程において、尿管芽tipが組織幹細胞の役割を担っていると考えられている。
我々はすでに分枝した尿管芽オルガノイドのtip部分を機械的に切離し、そこから分枝する尿管芽オルガノイドを再生することに成功している。その成果をもとに、ヒトiPS細胞から作製される尿管芽tip細胞の拡大培養法を確立すれば、そこから大量の分枝する尿管芽オルガノイドを再生し、供給可能となることが予想される。昨年度は、DiIで標識した超低密度リポタンパク質（very low-density lipoprotein; VLDL）の取り込みにより尿管芽tip細胞をモニタリングする方法を開発した。そして、ヒトiPS細胞由来の尿管芽オルガノイドを単一の尿管芽細胞にまで解離し、DiIで標識したVLDLを取り込む尿管芽tip細胞を選択的に増殖させる方法も開発した。そこで今年度は、拡大培養した尿管芽tip細胞から尿管芽オルガノイドを再生する方法を確立した。さらに、尿管芽tip細胞を70日以上の長期に渡り、尿管芽オルガノイドを再生する性質をたもったまま拡大培養することに成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
単一の腸幹細胞から腸オルガノイドが再生される過程において、一過性のYAP1活性化によって惹起されるNOTCHシグナルが重要であることが知られている（Serra D., 2019）。そこで、GSK3b阻害によってWnt/b-cateninシグナルを活性化する化合物であるCHIR99021の代わりにAfamin/Wnt3a conditioned mediumを用いたところ、YAP/TAZが活性化され、tip細胞コロニーから尿管芽オルガノイドの再生が可能となることが分かった。したがって、尿管芽オルガノイドから機械的に切離することなく、選択的に誘導し、拡大培養したtip細胞から尿管芽オルガノイドを再生する独自の培養法を開発することに成功した（Mae S., 2020）。
誘導された尿管芽tip細胞は、その特徴である幹細胞としての性質を保ったままin vitroで長期間の維持培養を行うことにより、安定かつ大量に分枝する尿管芽オルガノイドを作製できるため、マウスなどの初代尿管芽組織に代わり、腎臓発生生物学を研究するための有用なツールとなることが期待される。これまでに、TGFbetaシグナルは尿管芽分枝を抑制することが報告されており（Bush KT., 2004）、我々が誘導したiPS細胞由来尿管芽tip細胞はTGFbeta2を発現していた。そこで、TGFbetaシグナル阻害剤を用いて尿管芽tip細胞を培養したところ、70日以上もの長期間に渡り、尿管芽tip細胞マーカーであるRETおよびGATA3発現が維持され、尿管芽オルガノイドを再生する性質も保たれたまま拡大培養できることが分かった（論文未発表）。
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| Strategy for Future Research Activity |
尿管芽tip細胞を長期に渡り拡大培養することに成功し、安定かつ大量に尿管芽オルガノイドを作製できるようになったが、尿管芽tip細胞が同じ性質のまま維持されているか否かについてはまだ詳細な検討が必要である。そこで今後は、拡大培養を続けることによって尿管芽tip細胞の遺伝子発現プロファイルがどのように変化するのかを検証し、再生される尿管芽オルガノイドの違いを明らかにする。また、尿管芽tip細胞コロニーを単一の細胞にまで解離し、凍結保存が可能であるか検討を行う。
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