2020 Fiscal Year Research-status Report

Transcriptome analysis of kidney biopsied tissues of diabetic kidney disease

Research Project

Project/Area Number	19K08741
Research Institution	National Hospital Organization Chiba-East-Hospital
Principal Investigator	今澤俊之独立行政法人国立病院機構(千葉東病院臨床研究部), 腎センター, 腎センター長 (80348276)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2022-03-31
Keywords	糖尿病性腎臓病 / トランスクリプトーム解析 / 腎組織 / 結節病変 / バイオインフォマティクス解析
Outline of Annual Research Achievements	本研究では、糖尿病性腎臓病（DKD）において特徴的かつ予後不良所見とされてきた結節性病変（NL）を有する症例の腎生検残余検体を用い網羅的な遺伝子発現解析（トランスクリプトーム解析）を行うことで、NLの進行・抑制因子の同定を試みている。研究開始時点でも腎生検後1年以内の腎生検の残余検体から抽出したRNAを用いたトランスクリプトームは可能であった。しかし、前向き研究では予後がわかるまでに数年がかかること、後ろ向き研究でも数年の観察による判定が必要であり、過去検体でのトランスクリプトーム解析を可能とする技術が必要であった。まず昨年度、10年前の検体からでもマイクロアレイ解析に必要なcDNA量（2μg以上）を得られるようになった。本年度は、腎生検にて結節病変を確認できたDKD症例で3年以上経過を追えた症例の中から、予後不良例（eGFR低下速度が年間7ml/min以上）7例と予後良好例（eGFR低下速度が年間3ml/min未満）9例を選択し、それらの残余検体からRNAを抽出し、cDNAを合成した。得られたcDNA量は5.3±2.0μgであった。現在、Agilent社SurePrint G3 Human GE マイクロアレイ 8x60K（Ver. 3.0）にてトランスクリプトーム解析を実施しているところで、その結果が得られたのち、次年度にはパスウェイ解析（IPA（Ingenuity Pathways　Analysis）を行い、発現変動遺伝子の機能や代謝経路を明らかにしていく。また、残余ｃDNAを用いRT-PCRにてトランスクリプトーム解析の結果の確認をとる。更に、候補因子については、発現部位や蛋白発現動態を検討するために、同一症例の組織を使い、各候補因子に対する抗体を用い組織染色を行い、組織内での局在ならびに発現変化を検討する。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 研究開始時点でも腎生検後1年以内の腎生検の残余検体から抽出したRNAを用いたトランスクリプトームは可能であったが、昨年度は本研究の目的を果たすため10年前の検体からでもマイクロアレイ解析に必要なcDNA量（2μg以上）を得られるよう準備を整えた。本年度は、腎生検にて結節病変を確認できたDKD症例で3年以上経過を追えた症例を選択し、更に残余検体がある症例19例を選択し、RNAを抽出し、昨年度確立した方法に則りcDNAを作成した。3例においては2μg以下であったが、16例ではマイクロアレイ実施可能な2μg以上のcDNAが得られた。得られたcDNA量は5.3±2.0μgであった。内訳は、予後不良例（eGFR低下速度が年間7ml/min以上）7例と予後良好例（eGFR低下速度が年間3ml/min未満）9例である。現在、Agilent社SurePrint G3 Human GE マイクロアレイ 8x60K（Ver. 3.0）にてトランスクリプトーム解析を実施している。
Strategy for Future Research Activity	Agilent社SurePrint G3 Human GE マイクロアレイ 8x60K（Ver. 3.0）にて遺伝子発現解析を行っているが、現在、依頼施設での稼働が滞っており結果が遅れている。今後は、別施設での解析も検討する。マイクロアレイ解析データが得られた後は、パスウェイ解析（IPA（Ingenuity Pathways　Analysis）を行い、発現変動遺伝子の機能や代謝経路を明らかにしていく。また、残余ｃDNAを用いRT-PCRを行い遺伝子発現量についてマイクロアレイ結果の裏付けをとる。また、更に、候補因子については、発現部位や蛋白発現動態を検討するために、同一症例の組織を使い、各候補因子に対する抗体を用い組織染色を行い、組織内での局在ならびに発現変化を検討する。また、これらの遺伝子発現量や蛋白発現量と各種臨床パラメータの相関について統計学的な解析も行っていく。
Causes of Carryover	新型コロナウイルスの影響になどにより解析に遅れが生じ、計画通りの使用ができず次年度使用額が発生した。解析依頼する施設を変更及び増やすなどして適切な使用を検討している。