2019 Fiscal Year Research-status Report
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19K08754
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| Research Institution | Wakayama Medical University |
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Principal Investigator |
国本 佳代 和歌山県立医科大学, 医学部, 助教 (10438278)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
金澤 伸雄 和歌山県立医科大学, 医学部, 准教授 (90343227)
邊見 弘明 岡山理科大学, 獣医学部, 教授 (20451924)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | インタ－フェロン制御異常症 / 新規遺伝子変異 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は、まず病的意義が疑われる父親由来のXaと意義はないと思われる母親由来のXbの複合ヘテロ変異を持つ患児と両親の末梢血単核球および不死化B細胞を用い、IFNγ刺激後の細胞内STAT1リン酸化の程度をFACSで経時的に解析した結果、末梢血単核球においては、患児と父親で無刺激で陽性であり、IFNγ刺激後は特に患児で大きく増強した。不死化B細胞においては、父親で無刺激で陽性となり、IFNγ刺激後は患児と父親とも同程度に増強した。母親ではいずれも陰性であった。以上の結果から、Xb変異は単独では機能的な意義はないが、Xa変異と共存するとその機能を修飾する可能性が考えられた。また、末梢血単核球における I型IFN応答遺伝子の発現についてqRT-PCRにて検討した結果、患児と父親では6遺伝子のいずれも健常者コントロールより高値であり、患児と父親で発現量に大きな違いはなかった。さらに、患児と父親の皮疹の生検組織について免疫組織学的に検討した結果、患児ではMPO陽性好中球とCD68陽性マクロファージが主に浸潤するのに対して父親ではCD68陽性マクロファージとCD4、CD8陽性T細胞が主に浸潤し、p-STAT1の発現は両者の浸潤細胞ともに陽性で、父親でより強く発現が見られた。
次に、野生型XとXa、Xb変異遺伝子をそれぞれ発現ベクターに組み込んだプラスミドを作成して293T細胞に導入しXの発現をウェスタンブロットにて検討したが、分子量や発現量に明らかな差は見られなかった。そこで、これらのプラスミドをX欠損HAP1細胞に導入し、IFNγ刺激後の細胞内STAT1リン酸化をウェスタンブロットにて検討したが、Xa、Xb変異ともに野生型と明らかな差を認めず、Xの発現効率について再検討する必要がある。現在、293T細胞を用いたレポーターアッセイにて差が見られないか検討中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
In vitroの実験でXaとXb変異の機能的意義を示せておらず、まだマウス作成やタンパク質作成にとりかかれていない。
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| Strategy for Future Research Activity |
In vitroの実験でXaとXb変異の機能的意義を示すため、293T細胞での実験系において異なるレポーターシステムを用いたりSTAT1遺伝子導入を追加して機能解析を行うこと、X、XaとXb変異をウイルスベクターにつなぎ替えてHAP1細胞に導入することなどを検討している。これらによりXa変異の機能的意義が示されれば、変異導入マウスやタンパク質の作成を開始する。
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| Causes of Carryover |
In vitro実験で陽性所見が得られず、マウスやタンパク質作成に着手できなかったため
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