2020 Fiscal Year Research-status Report
新規尋常性白斑モデルマウスの作製と白斑発症機序の解明
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19K08770
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| Research Institution | Gifu University |
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Principal Investigator |
大沢 匡毅 岐阜大学, 大学院医学系研究科, 教授 (10344029)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
矢澤 重信 岐阜大学, 大学院医学系研究科, 助教 (30392153)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 尋常性白斑症 / 疾患モデルマウス / メラノサイト / トランスジェニックマウス / 自己免疫疾患 / ゲノム編集 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
尋常性白斑はメラノサイトが消失してしまうことにより皮膚に白斑が形成される疾患であり，白斑という外見上の病変によって患者のQOLが著しく低下してしまうことが問題である。尋常性白斑の病態には環境的要因，メラノサイトの異常，および免疫的な素因等が複合的に関与していることが示されているが，このような高次元な現象をin vitroで再現することは困難であり，その病態の理解には疾患モデル動物を用いたin vivoレベルでの研究が必須である。しかし，現存の尋常性白斑症モデル動物には様々な問題点があり，研究の推進の障害になっている。そこで，本研究では、ヒトの尋常性白斑を模倣する事ができる疾患モデルマウスを作製することともに，モデルマウスを用いて尋常性白斑発症の細胞的および分子的基盤を解明することを目的に研究を進める。
初年度は，尋常性白斑モデルマウスを作製することに注力した。ヒトと異なりマウスの毛包間上皮にはメラノサイトが存在せず，また皮膚は体毛によって覆われている。このため野生型マウスでは皮膚が白斑化する過程を観察する事が困難である。そこで，皮膚上皮にメラノサイトが有するK14-SCFトランスジェニックマウスやヘアレスマウスが尋常性白斑モデルマウスとして活用されている。しかし，これらのマウスは免疫系に異常があることが示されており，尋常性白斑症の病態を正確に再現できないことが示唆されていた。そこで，本研究では，遺伝子編集技術を応用し，毛包間上皮にメラノサイトを有しヘアレス化したマウスを作製した。また，メラノサイトに対する免疫反応を効率的に誘導するために，メラノソーム構造因子であるPmelタンパク質を認識するT細胞受容体(TCR)をT細胞特異的に発現するノックイントランスジェニックマウスを作製した。今後はこれらのマウスを交配させ得られたマウスについて尋常性白斑モデルとしての有用性を評価する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
各種ノックインマウスを作成するために，マウスES細胞に対しCRISPR/Cas9システムを用いて遺伝子編集を行なった。その結果，以下の3つのエレメントをそれぞれノックインしたマウスを得ることができた。今後、トリプルノックインしたマウスを作製し，新規尋常性白斑症モデルマウスとしての有効性を評価するとともに、疾患の発症機序を解明に役立てる。作製した各マウスの繁殖効率が悪く、トリプルノックインマウスの取得が遅れている。
1)メラノサイト抗原(Pmel)を認識するTCRα/β鎖をT細胞に発現させるために，テトラサイクリン応答性にTCRα/β鎖を発現するカセットをCD2遺伝子座にノックインした。これによって，T細胞発生時に起こるポジティブ/ネガティブセレクションによる自己応答性クローン排除の影響を避けるとともに、テトラサイクリン応答性にメラノサイト特異的な自己免疫反応を誘導する。
2)K14-SCFカセットをマウスES細胞のRosa26遺伝子座にノックインした。これによってマウスの皮膚上皮にSCFが強制発現を強制発現させ、毛包間皮膚上皮にメラノサイトが存在するヒト型皮膚をマウスで再現する。
3)毛包の毛球部特異的に発現するKrt35の遺伝子座にヘアレス変異遺伝子(Dlx3-TDO)をマウスES細胞にノックインした。これによって、マウスの無毛化を誘導しヒト型皮膚をマウスで再現するとともに、皮膚上皮における白斑化の評価を容易にする。
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| Strategy for Future Research Activity |
トリプルノックインマウスの取得が遅れを取り戻すために、自然交配とともに人工交配による繁殖をおこなう。作製されたトリプルノックインマウスをを用いて尋常性白斑症マウスモデルとしての有効性を評価する。有効性が確認されれば，トリプルノックインマウスからES細胞株を作製する。その後，遺伝子編集技術を用いて，作製されたES細胞に対し細胞性免疫に関与する分子をノックアウトした後，マウスを作製する。作製されたマウスの表現型解析を通じて，尋常性白斑症に影響を及ぼす分子や細胞系譜を特定する。
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| Causes of Carryover |
遺伝子改変マウスを作製しその表現型の詳細な解析を行う予定であったが、マウスの作製が遅れたため、次年度に解析を行うことにした。このため、当該年度に使用予定の解析費用を使わずに次年度に繰越したため。
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