らい菌の網羅的SNP解析－少菌型・多菌型決定因子、薬剤耐性変異、型別の解析－

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K08785
• Research Institution: National Institute of Infectious Diseases
• Principal Investigator: 岩尾 泰久 国立感染症研究所, 薬剤耐性研究センター, 主任研究官 (90813684)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 中田 登 国立感染症研究所, ハンセン病研究センター 感染制御部, 室長 (70237296)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: Leprosy / Paucibacillary (PB) / Multibacillary (MB) / SNP / Drug resistance / Nested multiplex PCR

Outline of Annual Research Achievements

ハンセン病はらい菌によって皮膚や末梢神経が侵される慢性感染症である。ハンセン病の病型には少菌型と多菌型があり、化学療法中の副反応であるらい反応の頻度や病態は全く異なる。また、らい菌は人工培養できないため、ヌードマウスを用いた特殊な手法を用いなければ臨床材料からの分離培養ができない。次世代シーケンサーによるゲノムシーケンシングは容易ではなく、ヒトのDNAが多量に混在する試料かららい菌のDNA情報のみを選択的に取得するような手法が必要となるため、DNAの選択的増幅による手法が求められる。現在、ハンセン病の薬剤耐性診断・感染経路の特定はDNA検査に依存している。本研究では、ヒトDNAを多量に含むハンセン病の臨床試料から、らい菌の塩基配列をゲノムワイドに収集し網羅的に解析することを目的とする。らい菌の薬剤耐性変異と膨大なSNP領域を一括して増幅可能なNested Multiplex PCR法とアンプリコン解析を組合せた実験系を構築する。SNPを用いたゲノムワイド関連解析により、薬剤耐性変異と型別の同定、少菌型・多菌型決定因子の探索、株間における遺伝多型の生物学的意義の解析を行う。
令和2年度初めまでに、らい菌のSNP型別と薬剤耐性遺伝子変異を同定できるNested Multiplex PCR法とアンプリコン解析を組合せた実験系を構築した。また、少菌型の完全ゲノム情報を取得するために、少型ハンセン病患者由来の臨床試料からヒトDNAを効率的に除去し、らい菌DNA濃縮法の開発を行っている。これまでに開発したnmPCR法を用いて、らい菌のSNP解析や薬剤耐性変異解析を進めている。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

本年度は、これまでに開発したらい菌の薬剤耐性変異とSNP型別を同時に決定するアンプリコン解析を併用したnmPCR法については論文を投稿し、現在、査読中である。少菌型の完全ゲノム情報を取得するために、ヒトDNAの除去及びらい菌のDNA濃縮を行なったが、少菌型由来の臨床試料にはらい菌の菌量は少ないため、らい菌のDNA濃縮には困難を極めた。そのため、ヒトに対する医学研究倫理審査で承認を得て、多菌型由来ハンセン病の皮膚切片より効率的にらい菌のDNA抽出方法の条件検討を行なっている。

Strategy for Future Research Activity

来年度以降も、少菌型の症例数が少ないため、少菌型由来の臨床サンプルをできる限り収集する。多菌型と少菌型を決定付ける因子を探索するために、臨床試料からヒトDNAを除去し、効率的にらい菌DNA抽出法を確立し、少菌型由来のらい菌のゲノム解析を行う。臨床サンプル中にらい菌DNAは少ないことが予想されるため、これまでに開発したnmPCR法によるらい菌のSNP情報をさらに収集し、両病型決定因子を探索する。

Causes of Carryover

英語論文の投稿費については、現在、論文審査中のため、計上しなかった。 また、学会参加費と旅費については、COVID-19の流行により国際学会に参加できなかったため、計上しなかった。
次年度に論文が受理された際に投稿費用に使用する予定である。国内外の学会に参加するために、参加費に支出する予定である。