2021 Fiscal Year Annual Research Report
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19K08786
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
岩田 浩明 北海道大学, 大学病院, 講師 (20397334)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
西江 渉 北海道大学, 医学研究院, 客員教授 (20443955) [Withdrawn]
氏家 英之 北海道大学, 大学病院, 講師 (60374435)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 水疱性類天疱瘡 / NC16A / 17型コラーゲン / 補体 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
抗原結合部位の入れ替えタンパクの作成。BP180のNC16A部位はアミノ酸配列が病原性に重要であるかエピトープ部位が重要であるか検証するため、NC16AドメインをBP180-C末に入れ替えを行った。CRISPR-Cas9技術によりKer-CT細胞に対して、まずCas9をウイルスベクターにより導入したCas9発現細胞を作成した。続いて、内因性BP180をノックアウトするため、BP180特異的ガイドRNAを用いて細胞を処理した。処理細胞からシングル細胞セレクションを行い、PCRおよびウエスタンブロットにて確認を行いBP180欠損細胞を樹立した。続いて、この樹立した細胞に対して、前年度作成した全長BP180のNC16A部位（AA514-520）をC末端（AA1476-1482）に移した変異タンパクを発現するウイルスベクターにより変異タンパク発現細胞を樹立した（Ker－CT_16-1、ポリクローン）。Ker-CT_16-1細胞が、BP180を発現して細胞膜上に提示、3本鎖コラーゲン構造を形成することを確認した。さらに、この細胞は残存するNC16A部位に対する抗体（TS39-3）で刺激をした際に、細胞内取り込みが生じることを確認した。つまり、作成した変異細胞は機能的に野生型細胞と類似の性質を保持しているいた。
現在、前年度樹立した入れ替えたNC16Aエピトープを認識するモノクローナル抗体の大量精製を行い、補体による細胞内取り込み作用増強効果について検証する最終実験の準備中である。
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