2020 Fiscal Year Research-status Report
新規治療の確立を目的とした全身性強皮症の血管病変モデルの作製
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19K08796
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| Research Institution | Oita University |
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Principal Investigator |
後藤 瑞生 大分大学, 医学部, 講師 (70433050)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
波多野 豊 大分大学, 医学部, 教授 (80336263)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 全身性強皮症 / iPS細胞 / 血管病変モデル / 創薬スクリーニング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
全身性強皮症は皮膚や内臓の線維化をきたす自己免疫性疾患であり、レイノー症状などの血管障害も認める。すなわち、免疫異常に加えて線維化と血管障害の２つの事象が複雑に絡み合って症状を来すが、これらの関係は未だ良くわかっていない。また、線維化の機序は解明されつつあるが、血管障害の機序はほとんど明らかになっていない。これは、患者の血管内皮細胞を使った適切な病変解析モデルが存在しないためである。そこで、本研究では全身性強皮症患者のiPS細胞から多様化能力を持った血管内皮細胞を誘導し、その血管内皮細胞を用いて管腔形成を行い、試験管内での血管病変モデルを作製することとした。管腔形成を行うことによって試験管内実験ではあるが、単層培養した血管内皮細胞の解析とは違い、より生体内に近い病態の解析ができる。
我々は、健常人（2名）と全身性強皮症患者（3名）のiPS細胞からそれぞれ血管内皮細胞の誘導を行った。健常人iPS細胞由来の血管内皮細胞は2名とも問題なく増殖し、さらに管腔形成実験でも問題なかった。一方、全身性強皮症患者iPS細胞由来の血管内皮細胞は、3名ともiPS細胞からの誘導は問題なかったが、誘導後の増殖能は極めて低く、健常人と同じ条件で管腔形成を行ったが、健常人と比較して明らかに管腔形成能は劣っていた。
現在、化合物ライブラリーを用いて全身性強皮症患者iPS細胞由来の血管内皮細胞の管腔形成を改善させる物質を探索中であるが、患者iPS細胞由来の血管内皮細胞は増殖能が極めて低く、化合物スクリーニングに時間を要している。また、患者iPS細胞由来の血管内皮細胞の増殖能及び管腔形成能が健常人と比較して劣っている原因因子を探索するため、iPS細胞由来の血管内皮細胞から抽出したRNAを用いて網羅的マイクロアレイ解析を行う予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究を継続させるため、健常人（2名）と全身性強皮症患者（3名）のiPS細胞からそれぞれ血管内皮細胞の誘導を繰り返し行っている。健常人及び全身性強皮症患者のiPS細胞そのものの維持培養及びiPS細胞から血管内皮細胞を誘導する過程は問題なかった。iPS細胞から血管内皮細胞を誘導後はフローサイトメーターにて適切なマーカーを発現している血管内皮細胞のみを回収している。
フローサイトメーターで回収後、健常人のiPS細胞由来の血管内皮細胞は増殖能に問題なく、管腔形成も認めた。一方、全身性強皮症患者のiPS細胞由来の血管内皮細胞は健常人と比較して、極めて増殖能が低く、管腔形成能も低かった。現在、化合物ライブラリーを用いて全身性強皮症患者のiPS細胞由来血管内皮細胞の管腔形成能を改善する化合物を探索中であるが、患者iPS細胞由来の血管内皮細胞の増殖能力が極めて低く、時間を要している。さらに、健常人及び患者iPS細胞由来の血管内皮細胞からRNAを抽出しており、患者iPS細胞由来の血管内皮細胞の増殖能及び管腔形成能が健常人と比較して劣っている原因因子を探索するため、網羅的マイクロアレイ解析を行う予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
健常人と比較して、全身性強皮症患者のiPS細胞由来血管内皮細胞の管腔形成能が低下していることが明らかとなっているので、今後は患者のiPS細胞由来血管内皮細胞の管腔形成能を改善させる化合物のスクリーニングを行い、全身性強皮症患者の血管病変の新規治療薬の開発を進める。
また、健常人及び全身性強皮症患者のそれぞれのiPS細胞由来血管内皮細胞からRNAを抽出し、網羅的マイクロアレイ解析を行い、両者を比較し、血管内皮細胞の増殖能及び管腔形成能に影響に与える原因因子を探索する。原因因子の候補はリアルタイムPCRで実際の遺伝子発現を確認し、さらにウェスタンブロッティングにて蛋白発現も確認し、候補を絞り込んでいく。最終的に遺伝子のノックダウン又は過剰発現実験によって原因因子を特定していく。
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| Causes of Carryover |
今年度は研究室の改築業務と重なり、一時的に研究が中断した時期があり、その間の消耗品の消費が途絶えた。加えて、新型コロナウイルスの蔓延に伴い、各実験機器メーカーからの消耗品も含めた様々な実験器具の納品が困難であった。生じた次年度使用額は、今年度に納品できなかった消耗品なども含めた追加購入費用として使用する予定である。
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