2021 Fiscal Year Research-status Report

新規治療の確立を目的とした全身性強皮症の血管病変モデルの作製

Research Project

Project/Area Number	19K08796
Research Institution	Oita University
Principal Investigator	後藤瑞生大分大学, 医学部, 講師 (70433050)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	波多野豊大分大学, 医学部, 教授 (80336263)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2023-03-31
Keywords	全身性強皮症 / iPS細胞 / 血管内皮細胞 / 血管病変モデル
Outline of Annual Research Achievements	全身性強皮症（以下SSc）は皮膚や内臓の線維化をきたす自己免疫性疾患であり、レイノー症状などの血管障害も認める。すなわち、免疫異常に加えて線維化と血管障害が複雑に絡み合って症状を来すが、これらの関係は未だ良くわかっていない。また、線維化の機序は解明されつつあるが、血管障害の機序はほとんど明らかになっていない。これは、患者の血管内皮細胞を使った適切な病変解析モデルが存在しないためである。そこで、本研究ではSSc患者のiPS細胞から多様化能力を持った血管内皮細胞を誘導し、その血管内皮細胞を用いて管腔形成を行い、試験管内での血管病変モデルを作製することとした。管腔形成を行うことによって試験管内実験ではあるが、単層培養した血管内皮細胞の解析とは違い、より生体内に近い病態の解析ができる。我々は、健常人（2名）とSSc患者（3名）のiPS細胞からそれぞれ血管内皮細胞の誘導を行った。健常人iPS細胞由来の血管内皮細胞は2名とも問題なく増殖し、さらに管腔形成実験でも問題なかった。一方、SSc患者iPS細胞由来の血管内皮細胞は、3名ともiPS細胞からの誘導は問題なかったが、誘導後の増殖能は極めて低く、健常人と比較して明らかに管腔形成能は劣っていた。残念ながら、染色体検査の結果、1名のSSc患者のiPS細胞に染色体異常を認めたため、健常人2名、SSc患者2名で解析を進めている。また、化合物ライブラリーを用いてSSc患者iPS細胞由来の血管内皮細胞の管腔形成を改善させる物質も探索予定であったが、患者iPS細胞由来血管内皮細胞の増殖能が極めて低く、困難な状況である。一方、患者iPS細胞由来の血管内皮細胞の増殖能及び管腔形成能が健常人と比較して劣っている原因因子を探索するため、iPS細胞由来の血管内皮細胞から抽出したRNAを用いて網羅的マイクロアレイ解析を行った。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 研究を継続させるため、健常人（2名）と全身性強皮症（以下SSc）患者（3名）のiPS細胞からそれぞれ血管内皮細胞の誘導を繰り返し行っていたが、追加した染色体検査にて、患者1名のiPS細胞において染色体異常が検出されたため、現在は健常人（2名）、SSc患者（2名）にて研究を行っている。健常人及びSSc患者のiPS細胞そのものの維持培養及びiPS細胞から血管内皮細胞を誘導する過程は問題なかった。iPS細胞から血管内皮細胞を誘導後はフローサイトメーターにて適切なマーカーを発現している血管内皮細胞のみを回収している。フローサイトメーターで回収後、健常人のiPS細胞由来の血管内皮細胞は増殖能に問題なく、管腔形成も認めた。一方、SSc患者のiPS細胞由来の血管内皮細胞は健常人と比較して、極めて増殖能が低く、管腔形成能も低かった。化合物ライブラリーを用いてSSc患者のiPS細胞由来血管内皮細胞の管腔形成能を改善する化合物を探索予定であったが、患者iPS細胞由来の血管内皮細胞の増殖能力が極めて低く、困難な状況である。一方、健常人及び患者iPS細胞由来の血管内皮細胞からRNAを抽出しており、患者iPS細胞由来の血管内皮細胞の増殖能及び管腔形成能が健常人と比較して劣っている原因因子を探索するため、網羅的マイクロアレイ解析を行った。Z-score値から健常人と患者の4通りの組み合わせから、SSc群において優位な発現変動があると予想された遺伝子のうち、上位及び下位20遺伝子を抽出した。4通りで共通した遺伝子は18遺伝子であった。現在、これら18遺伝子の実際の発現をリアルタイムPCRにて確認中である。
Strategy for Future Research Activity	健常人と比較して、全身性強皮症（以下SSc）患者のiPS細胞由来血管内皮細胞の管腔形成能が低下していることが明らかとなっているので、健常人及びSSc患者のそれぞれのiPS細胞由来血管内皮細胞から抽出したRNAを用いた網羅的マイクロアレイ解析で得られた18遺伝子からSScの血管内皮細胞の管腔形成能へ影響を与える原因を解析する。原因の候補遺伝子はリアルタイムPCRで実際の遺伝子発現を確認し、さらにウェスタンブロッティングにて蛋白発現も確認し、候補を絞り込んでいく。最終的に遺伝子のノックダウン又は過剰発現実験によって原因因子を特定していく。