2020 Fiscal Year Research-status Report
好中球SiglecへのVWFとADAMTS13の結合を介したNETs形成調節機構
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19K08829
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| Research Institution | National Cardiovascular Center Research Institute |
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Principal Investigator |
秋山 正志 国立研究開発法人国立循環器病研究センター, 研究所, 室長 (30298179)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
小亀 浩市 国立研究開発法人国立循環器病研究センター, 研究所, 部長 (40270730)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | Siglec / ADAMTS13 / VWF |
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| Outline of Annual Research Achievements |
フォン・ヴィレブランド因子(VWF)はSiglec-5によって取り込まれると報告されているが、その他のSiglec分子による取り込みについては不明であった。そこで、Siglec-5に加えて、SIglec-3/9/10/14発現細胞でのVWFの細胞内への取り込みを調べたところ、Siglec-9/14発現細胞においてVWFが取り込まれることを見出した。また、ADAMTS13の取り込みとは異なり、Siglec-5発現細胞によるVWF取り込みは細胞内のITIMおよびITIM様モチーフ内のチロシン残基の変異に影響されなかった。ADAMTS13とVWFの取り込みに関与するドメインを明らかにするために、Siglec-14のN末端V-setドメイン並びに隣接するC2-setドメインのそれぞれもしくは両方をSiglec-3の対応ドメインと取り換えたSiglec-14変異体発現細胞における取り込みを調べた。その結果、V-setドメインのみもしくはV-setドメインとC2-setドメイン両方をSiglec-3のドメインに置換した変異体発現細胞ではADAMTS13およびVWFの取り込みは起こらなかった一方、C2-setドメインをSiglec-3のものに取り換えた変異体発現細胞には取り込まれることが分かった。さらにV-setドメインのＮ末端側（Glu17-Lys83、Glu17-Lys145）欠失変異を作成して取り込みを調べたところ、いずれの変異体でも取り込みが阻害されることが分かった。この領域内に存在する脂質リガンド分子の結合に必須の2つのLeu残基変異（L35T/L38T)は影響を及ぼさなかった。以上の結果から、Siglec-5/14による取り込みにはN末端側V-setドメイン（特にN末端側）が必要である可能性が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
初年度において主にADAMTS13の取り込みに関してSiglec-5の細胞内機能ドメインの変異の影響を調べた。2年度にはVWFの取り込みに関するSiglec-5以外のSiglecの関与を調べ、Siglec-5とほぼ同一のリガンド結合領域を持つSglec-14に加えて、Siglec-9もVWFの取り込みに関与することを新たに見出した。また、ADAMTS13とVWFでは細胞内モチーフ変異の影響も異なることも見出した。一方、その生理学的な影響については計画では好中球を用いてNETsに対する影響を調べる予定であった。すでに実験には着手済みであるが、in vitroでのneutrophil extracellular traps (NETs)形成実験での安定的なNETs形成およびその定量化に手間取っており、現状の進捗状況はやや遅れている。最終年度においては、ADAMTS13やVWFがNETs形成にどのような影響を及ぼすかを比較・検討し、その生理学的な意義を明らかにすることを考え、現在NET形成実験の最適化に取り組んでいる。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでは培養細胞でSiglecを発現させてADAMTS13およびのVWFの取り込みに関与するSiglec5/14の機能を解析してきた。両分子はともにヒト好中球上に高発現している。同様にSiglec-5/14のリガンドであるB群連鎖球菌のβタンパク質はSiglec-5/14を介して、好中球の免疫機能である最近注目されているNETs形成を調節していることが報告されている。したがって、ADAMTS13およびVWFもSiglec-5/14を介して好中球の免疫機能を同様に調節している可能性がある。残された期間で、分離したヒト好中球のin vitroにおけるNETs形成へのADAMTS13およびVWFの影響を調べることを今後の研究のメインテーマにしようと考えている。すでに分離した好中球で用量依存的にLPS刺激によるNETs形成が起ることを確認しており、今後実験条件を最適化した後、ADAMTS13およびVWFのNETs形成への影響を調べる予定である。
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| Causes of Carryover |
次年度用にプラスチック製品購入費を残したため。
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