2020 Fiscal Year Research-status Report
Involvement of TP53 mutations in chemoresistance of B-precursor acute lymphoblastic leukemia
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19K08833
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| Research Institution | University of Yamanashi |
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Principal Investigator |
赤羽 弘資 山梨大学, 大学院総合研究部, 助教 (90377531)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 急性リンパ性白血病 / TP53変異 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、TP53変異がB前駆細胞型急性リンパ性白血病（BCP-ALL）の抗がん剤耐性に与える影響を解析し、予後不良なTP53変異陽性BCP-ALLに対する新たな治療戦略を開発・発展させることである。本年度は、昨年度に樹立したBCP-ALL細胞株のTP53変異導入クローンの詳細な解析を行った。また、TP53変異を高率に有するlow-hypodiploid ALLに対する有効性が前臨床モデルで報告されているPI3K阻害剤とBCL2阻害剤について、これらの薬剤に対する感受性をBCP-ALL細胞株のTP53変異導入クローンで検討した。
昨年度に私達は、TP53変異がBCP-ALLの薬剤感受性に与える影響を検討するために、TP53変異のホットスポット（F109、E221、R248）近傍を特異的に認識して切断するCRISPR/Cas9を設計し、TP53野生型のヒトBCP-ALL細胞株（697細胞とNalm6細胞）に導入した。こうしたCRISPR/Cas9による変異（ノックアウト）の誘導でTP53機能が失活した細胞をMDM2阻害剤（Nutlin-3a）で選別し、得られた個々のNutlin-3a耐性クローンの遺伝子配列をTAクローニング後にシークエンス解析したところ、TP53遺伝子におけるCRISPR/Cas9の標的部位近傍にランダムな塩基の挿入・欠失が確認された。次に、樹立したTP53変異クローンのPI3K阻害剤（GDC-0941）とBCL2阻害剤（ABT-199）に対する感受性を検討したところ、GDC-0941に対してはNalm6細胞と697細胞のTP53変異クローンで親株と同程度の感受性が認められ、ABT-199に対してはNalm6細胞のTP53変異クローンで親株と同程度の感受性が、697細胞のTP53変異クローンではむしろ耐性傾向を示すことが確認された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまでの研究で、私達はCRISPR/Cas9によるゲノム編集技術を用いてTP53野生型のヒトBCP-ALL細胞株からTP53変異（ノックアウト）クローンの作成を試みた。作成したクローンはMDM2阻害剤（Nutlin-3a）の存在下で選択的に増殖したことからTP53機能が失活しており、実際にTP53遺伝子におけるCRISPR/Cas9の標的部位近傍にランダムな塩基の挿入・欠失が確認されたことから、目的とするTP53変異（ノックアウト）クローンが得られたと考えられた。さらに、私達は、ヒトBCP-ALL細胞株においてTP53変異の導入が複数の抗がん剤（ビンクリスチン、ダウノルビシン、シタラビン）に対する耐性を誘導することを確認した。これらの結果は、TP53変異が予後不良なlow-hypodiploid ALLの背景因子であるだけでなく、BCP-ALLの薬剤耐性や予後不良にも関与している可能性を示唆している。今後は、樹立したTP53変異クローンの抗がん剤耐性の機序を解明するとともに、本研究の最終目標であるTP53変異陽性BCP-ALLの予後不良を克服する新たな治療戦略の開発を目指す。
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| Strategy for Future Research Activity |
（1）樹立したTP53変異クローンの分子生物学的解析
これまでの研究で得られたBCP-ALL細胞株のTP53変異クローンは、CRISPR/Cas9システムにより切断された二本鎖DNAが非相同末端再結合（NHEJ）による修復の過程でランダムに塩基の挿入・欠失が生じたHeterogenousな細胞集団である。これらの細胞は、MDM2阻害剤の存在下で選択的に増殖したことからTP53機能が失活していると考えられるが、個々の細胞がどのようなTP53遺伝子の異常を有しているのかは不明である。そこで、樹立した変異導入クローンにおけるTP53遺伝子異常を詳細に検討するために、シングルセルRNA-seq解析を実施する。
（2）TP53変異陽性BCP-ALLに対する治療戦略の開発
TP53変異を高率に有するlow-hypodiploid（染色体数32～39本）のBCP-ALL細胞ではPI3K-AKT経路が恒常的に活性化されており、これらの白血病はPI3K阻害剤に感受性を示すことが報告されている。また、low-hypodiploidを含む低二倍体（染色体数44本以下）のBCP-ALLに対して抗アポトーシス蛋白であるBCL2の阻害剤が有効であると報告されており、予後不良な低二倍体陽性ALLに対する有望な治療として期待されている。そこで、本研究で樹立したTP53変異クローンにおけるPI3K-AKT経路の活性化状態やBCL2の発現レベルを親株と比較して、TP53変異がもたらす影響を直接的に検証する。一方、今年度の研究結果では、PI3K阻害剤とBCL2阻害剤のTP53変異クローンに対する単独での有効性を確認できなかった。今後は、これらの阻害剤と既存の抗がん剤との併用効果をTP53変異クローンで検討し、TP53変異陽性BCP-ALLに対する有効な治療戦略の開発を目指す。
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| Causes of Carryover |
本解析の大部分は、研究室および実験機器センターの既存の設備で解析が可能であるため、実際には細胞株の維持やCRISPR/Cas9システムを用いたTP53遺伝子変異クローンの樹立、薬剤感受性試験にかかる消耗品購入費用が研究経費の大部分を占めた。今後予定している解析の研究経費に関しても、同様に消耗品の購入費用が大半を占める。消耗品のうち最も経費を要するのが白血病細胞の培養系で、牛胎児血清とサイトカインのためにそれぞれ60万円、培養容器のために10万円を計上した。また、TP53変異クローンとその親株におけるシグナル伝達経路の活性化状態や抗アポトーシス蛋白の発現を確認するためにウェスタンブロット解析を行うが、その解析で用いる抗体を購入するために20万円を計上した。さらに、薬剤感受性試験で用いる分子標的薬や抗がん剤の購入費用として20万円、薬剤感受性試験の試薬として10万円を計上した。
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