2020 Fiscal Year Research-status Report
RUNX1による造血幹細胞分化プロセスの解明と新たな分子標的薬の開発
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19K08845
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| Research Institution | Kyoto Prefectural University of Medicine |
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Principal Investigator |
忠垣 憲次郎 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (30416268)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
奥田 司 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (30291587)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 転写因子 / RUNX1 / プロモーター |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度はRUNX1の遺伝子発現を制御する新規転写因子の同定を試みた。RUNX1プロモーター領域（P１とP2）に結合する転写因子をin silico解析により調べた結果、２種を新規候補転写因子として選定することができ、以下の検討を行った。
（１）これら２種(A,B)の候補転写因子によるRUNX1プロモーター領域の転写活性化能をルシフェラーゼアッセイにて検討した。ヒト慢性骨髄性白血病由来K562細胞に対し、Amaxaを用いた電気パルスによりそれぞれの遺伝子発現プラスミドとルシフェラーゼベクターを導入し、24時間後にルシフェラーゼアッセイを行った。その結果、A遺伝子によりP１とP2共に転写活性は抑制された。一方、B遺伝子によりP１とP2共に転写活性は促進された。次にヒト子宮頸がん由来HeLa細胞に対し、リポフェクション法によりそれぞれの遺伝子発現プラスミドとルシフェラーゼベクターを導入し、24時間後にルシフェラーゼアッセイを行った。その結果、これら２種の遺伝子によりP１とP2共に転写は活性化されなかった。
（２）次に、これら２種(A,B)の候補転写因子がRUNX1の遺伝子発現を制御しているかを確認した。ヒト慢性骨髄性白血病由来K562細胞及びヒト急性リンパ芽球白血病由来Jurkat細胞に対し、Amaxaを用いた電気パルスによりそれぞれの遺伝子発現プラスミドを導入し、24時間後RNAを精製後、リアルタイムPCRにて相対定量比較を行った。その結果、これらの細胞でA遺伝子によりRUNX1遺伝子の発現は抑制され、B遺伝子によりRUNX1遺伝子の発現は促進されていることを確認することができた。
以上より、これら２種の候補転写因子がRUNX1の遺伝子発現を制御する可能性が示唆された。これらのことから、RUNX1は２種の新規標的遺伝子である可能性が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の計画通り新規に選定したRUNX1の遺伝子発現を制御する２種の候補転写因子について、ルシフェラーゼアッセイによる転写活性測定とリアルタイムPCRによる遺伝子発現解析を行い、これらがRUNX1の遺伝子発現を制御する可能性があることが示唆される結果が得られたことから、ここまでのところ順調に計画が進行しているものと考えている。また、これら２種の候補転写因子が、RUNX1遺伝子発現作用を１種が正に、もう１種が負に制御するものとして見出せたことは、今後これら候補転写因子によるRUNX1遺伝子発現機構を詳細に解明していくうえで役に立つ転写因子であると期待している。
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| Strategy for Future Research Activity |
最終年度は、まずこれら２種の候補転写因子によるRUNX1遺伝子発現の分子機構を解明するため、クロマチン免疫沈降法を行い、実際にこれら２種の転写因子がRUNX1プロモーター領域に結合しているかどうかを検討する。同時に、RUNX1の遺伝子発現についてタンパクレベルでも検討したい。また、これらの転写因子が他の分子と複合体を形成し、転写因子による転写活性がP１とP2で異なる可能性が考えられることから、どのような分子が関与しているかなどについて検討し、これら２種の候補転写因子によるRUNX1プロモーター領域に対する作用の評価を確定する。さらに、これら２種の候補転写因子によるRUNX1遺伝子発現の制御がどのような生理作用をもつのかについての解析も試みたい。まずは、ES細胞とこれら２種の候補転写因子ノックダウン系を用いて、細胞の分化能力及び増殖能力を評価するコロニー形成法で手掛かりをつかみたい。
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