2019 Fiscal Year Research-status Report
Analysis of familial platelet disorder based on the novel function of RUNX1
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19K08852
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
鈴木 貴紘 国立研究開発法人理化学研究所, 生命医科学研究センター, 上級研究員 (00553661)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 家族性血小板異常症 / DNAメチル化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
すでに他機関で樹立済みのFPD-iPS細胞は保存中の質の低下により入手が困難であった。そのため、健常者から樹立されたiPS細胞にCRISPR/CAS9システムを用いてFPDで報告のある変異を導入した。変異導入細胞プールをT7E1アッセイで確認したところ、変異導入細胞の存在が確認された。変異導入細胞プールから単一細胞由来の細胞株をクローニングし、変異導入箇所のシークエンスをTAクローニングで確認することで、片アレルのみに適切な変異が導入された３株のFPDモデルiPS細胞を樹立することに成功した。このうち２株と野生型のiPS細胞を胚様体形成法によりin vitroで造血前駆細胞への分化誘導を試みたが、血管内皮細胞系列と思わるCD34+細胞は得ることができたが、造血前駆細胞マーカーであるCD34+CD45+を発現する細胞を十分に得ることができなかった。そのため、分化誘導方法検討し、２次元培養による分化誘導法をもとに培養の日数やコロニーサイズを最適しすることで、分化誘導開始１９日目でCD35+CD45+細胞を得ることに成功した。得られたCD34+CD45+造血前駆細胞とCD34+CD45-血管内皮細胞をセルソーターでソーティングし、メチレーションアレイでメチローム解析を行った。野生型iPS細胞から分化誘導した造血前駆細胞と血管内皮細胞とFPDモデルiPS細胞から誘導した造血前駆細胞と血管内皮細胞をそれぞれ比較し、FPDモデルiPS細胞由来造血前駆細胞と血管内皮細胞でそれぞれ特異的なDNAメチル化異常を同定することに成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
FPDモデルiPS細胞の樹立、造血前駆細胞への分化誘導、そのメチローム解析と概ね計画通りに研究を行うことができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
今回樹立したFPDモデルiPS細胞の分化誘導効率があまり高くなかったため、分化誘導効率のさらなる最適化を行う。最適化された分化誘導法によって分化誘導を行い、トランスクリプトーム解析、全ゲノムメチローム解析、DNAメチル化異常のレスキュー実験を行っていく。
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| Causes of Carryover |
当該年度の所要額のはほぼ計画通りに執行し、次年度使用額は所要額の１％以下であった。次年度使用額は物品費として使用する。
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