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2020 Fiscal Year Research-status Report

血栓形成における12-リポキシゲナーゼの局在・活性制御メカニズムの解明

Research Project

Project/Area Number 19K08853
Research InstitutionNational Center for Geriatrics and Gerontology

Principal Investigator

勝見 章  国立研究開発法人国立長寿医療研究センター, 病院, 部長 (80378025)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 天野 睦紀  名古屋大学, 医学系研究科, 准教授 (90304170)
Project Period (FY) 2019-04-01 – 2022-03-31
KeywordsRho GTPase / アラキドン酸 / 血栓形成
Outline of Annual Research Achievements

アラキドン酸リポキシゲナーゼ(ALOX)とその下流の脂質メディエーターは動脈硬化、血小板凝集、慢性炎症、がんの進展などに関与する多機能蛋白である。ALOX下流の脂質メディエーターについては活発に研究が行われているが、上流の制御メカニズムについては殆ど報告がなされていない。当該研究ではALOXの細胞内局在をRho family GTPaseが制御しており、動脈硬化部位、免疫器官など多様な臓器に脂質メディエーターをリクルートする際に Rho-ALOX経路が重要であるという仮説を証明するために蛋白生化学、マススペクトロメトリー、加齢マウスモデル、各種ノックアウトマウスを用いた動物実験を計画した。我々はRhoA, Rac1, Cdc42などに加え、RhoH, Rac2等の血球特異的GTPaseをbaitにした網羅的アフィニティクロマトグラフィーとそれに続くマススペクトロメトリー(LC/MS-MS)の実験系を確立し、GTP結合型の活性型活性型RhoAに特異的に結合する複数の蛋白を同定した。そのうちアラキドン酸リポキシゲナーゼ-12(ALOX12)が活性型RhoAに結合することを見いだした。RhoAとALOX12をCOS-1細胞内で発現したところ両者の直接の結合は認められなかった。一方でRhoAエフェクターforminとALOX12の結合がCOS-1細胞での発現実験で証明された。このことからALOX12はforminを介して活性型RhoAに結合することが判明した。GTPaseの阻害薬によるALOX下流脂質メディエーターの抑制効果の証明 ALOXとの活性化依存性の結合が明らかになったRho family分子につきそれぞれの阻害剤を内因性のALOXが発現した細胞に添加し、脂質メディエーター(ロイコトリエン、リポキシン、HETEなど)の産生が抑制されるかどうかをELISAで検討した。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究ではRhoファミリーGTPaseをbaitにした網羅的アフィニティクロマトグラフィーとそれに続くマススペクトロメトリー(LC/MS-MS)の実験系を確立し、血小板細胞質分画からGTP結合型の活性型活性型RhoAに特異的に結合する複数の蛋白を同定した。そのうちアラキドン酸リポキシゲナーゼ-12(ALOX12)が活性型RhoAに結合することを見いだした。RhoAとALOX12の直接の結合は認められなかったが、RhoAエフェクターforminとALOX12の結合がCOS-1細胞での発現実験で証明され、ALOX12はforminを介して活性型RhoAに結合することが判明した。GTPaseの阻害薬によるALOX下流脂質メディエーターの抑制効果の証明 ALOXとの活性化依存性の結合が明らかになったRho family分子につきそれぞれの阻害剤を内因性のALOXが発現した細胞に添加し、脂質メディエーター(ロイコトリエン、リポキシン、HETEなど)の産生抑制を測定する系を既に確立している。以上のことから研究計画は概ね順調に進展していると考えられる。

Strategy for Future Research Activity

1)巨核球細胞株MEG-O1、CMK-86にL63RhoA(活性型)とN19RhoA(不活性型)を発現し、培養上清中の12-HETE産生がL63RhoAにより亢進することを確認する。さらに活性型RhoAによる12-HETE産生亢進がRhoA、forminの阻害薬であるC3 toxin、SMIFH2により抑制されるが、Rho-kinase阻害剤Y-27632では抑制されないことを証明する。
2)GST-forminを洗浄血小板に混和しcytoplasmicアクチン重合アッセイとpyreneラベル精製アクチンアッセイの双方でアクチン重合の定量を行い、12-LOX阻害剤ML355によりformin上でのアクチン重合が阻害されるかどうか検討する。これにより12-LOXがforminを介したアクチン重合を制御していることを証明する。また、ML355の添加による血小板のアクチン形態変化をRhodamine Phalloidin染色で観察する。
3)RhoA欠失マウスから分離した血小板の、アゴニスト刺激時の12-LOXの局在、12-HETE分泌量をそれぞれ免疫染色、ELISAで測定し、野生型マウス血小板と比較する。

Causes of Carryover

(理由)
当該年度において、アフィニティクロマトグラフィー、シグナル伝達実験はすべて所属機関および名古屋大学に設置されている機器および専門オペレーターによりデータを得ることができ、経費の削減ができたため。
(使用計画)
令和3年度は国立長寿医療研究センターにおいて巨核球細胞株を用いたRhoA強制発現、また阻害薬による細胞生物学的研究、アクチン重合アッセイ、RhoA欠失マウスから分離した血小板を用いた実験のために予算執行をしていく。

  • Research Products

    (11 results)

All 2021 2020

All Journal Article (6 results) (of which Peer Reviewed: 6 results,  Open Access: 5 results) Presentation (3 results) Book (2 results)

  • [Journal Article] Essential role of a carboxyl‐terminal α‐helix motif in the secretion of coagulation factor XI2021

    • Author(s)
      Hayakawa Yuri、Tamura Shogo、Suzuki Nobuaki、Odaira Koya、Tokoro Mahiru、Kawashima Fumika、Hayakawa Fumihiko、Takagi Akira、Katsumi Akira、Suzuki Atsuo、Okamoto Shuichi、Kanematsu Takeshi、Matsushita Tadashi、Kojima Tetsuhito
    • Journal Title

      Journal of Thrombosis and Haemostasis

      Volume: 19 Pages: 920~930

    • DOI

      10.1111/jth.15242

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Myh9 R702C is associated with erythroid abnormality with splenomegaly in mice2021

    • Author(s)
      Kanematsu T, Suzuki N, Tamura S, Suzuki A, Ishikawa Y, Katsumi A, Kiyoi H, Saito H, Kunishima S, Kojima T, Matsushita T.
    • Journal Title

      Nagoya J Med Sci.

      Volume: 83 Pages: 75-86

    • DOI

      10.18999/nagjms.83.1.75

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Impact of variation in reagent combinations for one‐stage clotting assay on assay discrepancy in nonsevere haemophilia A2020

    • Author(s)
      Suzuki Atsuo、Suzuki Nobuaki、Kanematsu Takeshi、Okamoto Shuichi、Tamura Shogo、Kikuchi Ryosuke、Katsumi Akira、Kiyoi Hitoshi、Kojima Tetsuhito、Matsushita Tadashi
    • Journal Title

      International Journal of Laboratory Hematology

      Volume: 43 Pages: 131~138

    • DOI

      10.1111/ijlh.13335

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Aberrant X chromosomal rearrangement through multi‐step template switching during sister chromatid formation in a patient with severe hemophilia A2020

    • Author(s)
      Tokoro Mahiru、Tamura Shogo、Suzuki Nobuaki、Kakihara Misaki、Hattori Yuna、Odaira Koya、Suzuki Sachiko、Takagi Akira、Katsumi Akira、Hayakawa Fumihiko、Okamoto Shuichi、Suzuki Atsuo、Kanematsu Takeshi、Matsushita Tadashi、Kojima Tetsuhito
    • Journal Title

      Molecular Genetics & Genomic Medicine

      Volume: 8 Pages: 1-12

    • DOI

      10.1002/mgg3.1390

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Higher FVIII:C measured by chromogenic substrate assay than by one-stage assay is associated with silent hemophilic arthropathy2020

    • Author(s)
      Ogawa Mika、Suzuki Nobuaki、Takahashi Nobunori、Tamura Shogo、Suzuki Atsuo、Suzuki Sachiko、Hattori Yuua、Kakihara Misaki、Kanematsu Takeshi、Kojima Toshihisa、Katsumi Akira、Hayakawa Fumihiko、Kojima Tetsuhito、Ishiguro Naoki、Kiyoi Hitoshi、Matsushita Tadashi
    • Journal Title

      Thrombosis Research

      Volume: 188 Pages: 103~105

    • DOI

      10.1016/j.thromres.2020.01.003

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Truncated RUNX1 Generated by the Fusion of RUNX1 to Antisense GRIK2 via a Cryptic Chromosome Translocation Enhances Sensitivity to Granulocyte Colony-Stimulating Factor2020

    • Author(s)
      Abe Akihiro、Yamamoto Yukiya、Katsumi Akira、Yamamoto Hideyuki、Okamoto Akinao、Inaguma Yoko、Iriyama Chisako、Tokuda Masutaka、Okamoto Masataka、Emi Nobuhiko、Tomita Akihiro
    • Journal Title

      Cytogenetic and Genome Research

      Volume: 160 Pages: 255~263

    • DOI

      10.1159/000508012

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Presentation] 当センターにおける静脈血栓塞栓症発症の危険因子2020

    • Author(s)
      勝見 章,室谷健太、鴨下園子、伊藤美由紀、松下 正、小嶋哲人
    • Organizer
      第82回日本血液学会学術集会
  • [Presentation] 高齢者における静脈血栓塞栓症発症の症例対照研究2020

    • Author(s)
      勝見 章、室谷 健太、鴨下 園子、伊藤 美由紀、田村 彰吾、鈴木 伸明、松下 正、小嶋 哲人
    • Organizer
      第42回日本血栓止血学会学術集会
  • [Presentation] Template switchingによるF8エクソン15欠損が認められた重症血友病A症例2020

    • Author(s)
      所 真昼, 田村 彰吾, 鈴木 伸明, 大平 晃也, 河島 史華, 早川 友梨, 早川 文彦, 岡本 修一, 兼松 毅, 勝見 章, 松下 正, 小嶋 哲人
    • Organizer
      第42回日本血栓止血学会学術集会
  • [Book] 老年医療グリーンノート(悪性リンパ腫)2021

    • Author(s)
      鴨下園子、勝見 章
    • Total Pages
      500
    • Publisher
      中外医学社
  • [Book] 老年医療グリーンノート(骨髄異形成症候群)2021

    • Author(s)
      勝見 章
    • Total Pages
      500
    • Publisher
      中外医学社

URL: 

Published: 2021-12-27  

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