安定同位体標識アミノ酸を用いた質量分析計による薬剤耐性菌検出法の確立

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K08927
• Research Institution: Kameda University of Health Sciences
• Principal Investigator: 渡 智久 亀田医療大学, 総合研究所, 客員研究員 (50824736)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: MALDI-TOF MS / SILAC / 薬剤耐性菌

Outline of Annual Research Achievements

近年提唱されている安定同位体標識法を前処理に利用するSILAC法は、抗菌薬原末の使用による煩雑な操作や薬剤耐性の判定が目視であることに課題がみられ、 臨床現場での実用化に至っていない。本研究では、①SILAC法に薬剤ディスクを使用して簡便化を図ること、②SILAC法で処理した臨床由来の薬剤耐性株のマスス ペクトルをリファレンスライブラリーに登録することの2つによって、薬剤耐性菌の検出の自動判定を可能にすることを目的としている。
本年度は、MRSAの自動判定の精度を向上させるためのプロトコールの改良が課題となっていた。しかし、一部のアミノ酸溶液では作成後の時間経過とともに析出物が生じてしまう等の前処理試薬の保存安定性に課題が生じてしまい、長期保存を避けなければならなくなった。さらに、作成タイミングの異なる前処理試薬では、MSSAとMRSAの微妙なスペクトルの変化が、本来SILAC法によって起こりうる現象なのか、前処理試薬のLOT間差の影響によって生じているものなのかが正しく評価できないため、同じタイミングで作成した前処理試薬を使用した検証が必要であるとの考えにも至った。そこで、前処理試薬の汚染や保存安定性を考慮し、より短期間に多数の臨床分離株の評価を一度に実施することとし、2020年度はMRSA、ESBL産生菌、カルバペネマーゼ産生菌、フルオロキノロン耐性大腸菌の臨床分離株の収集期間とした。既に、MRSA、ESBL産生菌は、検証に十分な臨床分離株数の収集が完了している。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

同じタイミングで作成した前処理試薬を使用して、より短期間に多数の臨床分離株の評価を一度に実施することとしたため、2020年度は臨床分離株の収集を行ったために、当初の計画からは遅れている。

Strategy for Future Research Activity

MRSAの自動判定の精度向上に向けて、臨床分離株を用いた検証を再開し、プロトコルを完成させる。また、MRSA検出用のプロトコールを基本として、基質 拡張型βラクタマーゼ産生菌（ESBL）、カルバペネマーゼ産生菌（CARBA）、フルオロキノロン耐性大腸菌のSILAC法のプロトコールを作成し、リファレンスライブラリーの判定能の評価へと進めていく。さらに、ESBLとCARBAは表現型と遺伝子型の確認を実施していく予定である。さらに、これらのプロトコールを用いて、血液培養陽性ボトルでの直接検出に繋げていく予定である。

Causes of Carryover

2020年度は検証を行わずに臨床分離株の収集期間としたために試薬の使用機会が無かった。202年度は、ESBL産生菌およびカルバペネマーゼ産生菌の遺伝子型の確認用PCR試薬、各種アミノ酸、安定同位体リジンの購入費用に1100,000円、寒天培地、DMEMの購入費用に450,000円、電子天秤購入費用に150,000円を計上する予定である。