2019 Fiscal Year Research-status Report
B型肝炎ウイルスのステルス性による慢性感染成立の機序解明と阻止分子標的の創薬
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19K08937
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| Research Institution | Jikei University School of Medicine |
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Principal Investigator |
坪田 昭人 東京慈恵会医科大学, 医学部, 教授 (90322643)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | B型肝炎ウイルス / B型肝炎 / 肝炎慢性化 / microRNA / miRNA |
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| Outline of Annual Research Achievements |
B型肝炎は世界に蔓延しており、とりわけ慢性化への対応が急務である。それは肝炎が慢性化してしまえば、B型肝炎ウイルス（hepatitis B virus, HBV）のウイルス学的特性上、感染肝細胞からの完全排除は困難だからである。これを克服するには、感染の慢性化阻止が有力な一つの治療戦略になり得る。申請者らはヒト化肝臓キメラマウスモデルを独自に作製、そのモデルにHBVを感染させて肝組織内トランスクリプトームを解析した結果、感染直後より持続的に高発現する3つのmicro RNA(miRNA)とHBVのステルス(stealth) 性を示唆する遺伝子プロファイルが得られた。
これらの知見は慢性感染の成立機序を解く鍵になり、肝炎が慢性化するとHBVを排除する治療がない現在、その状況を打開するために重要である。本研究は、in vitro及びキメラマウスを用いた感染実験により、① miRNAがHBVのステルス性にどう関与しているのか、② miRNAと標的mRNAが慢性化を阻止する分子になるのか、③ 核酸アナログ体との併用でHBVを排除できるのか、を検討し、慢性化の成立機序をmiRNA/標的mRNAを中心に解明する。これによりB型肝炎の慢性化阻止に向けた新たな分子標的の創薬が期待される。
現在、miRNAと特異的なcounterpartである標的mRNAが慢性感染への成立にどのように関与しているか、それらのknockdown/overexpressionが慢性化の成立・非成立にどの程度関与しているか、強ければ慢性化を阻止できる程度なのかなど、詳細に検討しているところである。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
ヒト化肝臓キメラマウスモデルにHBVを感染させた実験で、肝炎直後より発現が抑制されているmRNA群において、申請者らが同定した3つのmiRNAと特異的に結合するであろうmRNAをin silicoで検索した。数十以上に及ぶmRNAに対してreal-time PCRでvalidationを行った。そのvalidationされたmRNAとmiRNAとの特異性を確認するためにluciferase reporter assayを行っており、一部は現在も特異性の確認を継続中である。
候補miRNA/標的mRNA の抗ウイルス効果と持続感染の阻止効果を、HBV 自立産生細胞株Hep38.7-Tet cells あるいはHepG2 2.2.15 に対し、各 mimic/inhibitor miRNA や標的mRNA のsiRNA をtransfect 後、肝細胞内HBV DNA, cccDNA や培養上清中のHBV DNA, HBV 関連抗原を定量し抗HBV 効果を繰り返し実験している。またヒトprimary 肝細胞のPXB-cells にHBV とmiRNA あるいはsiRNA をco-transfect して感染効率や複製効率をみており、その効果を確認中である。
各々の候補miRNAの標的mRNAが数十以上に及び、そのvalidationと特異性を確認するためのluciferase reporter assayやknockdown/overexpressionの実験系に用いるベクター構築に時間がかかった。またin vitro感染系の条件を試行錯誤で設定しているため予定以上に時間がかかり、結果的にやや遅れている。
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| Strategy for Future Research Activity |
申請者らが同定したmiRNAと標的mRNAをさらに発展的に研究する。現在までにvalidationしたmRNAも含めて、miRNA/標的mRNAが実際の肝細胞内でどのような生物学的意義を持っているのか、その機能について種々の肝細胞を用いて検証を行う。同時に各々のmiRNA/標的mRNA をknockdown/overexpressionしてHBV 感染・複製効率を精査し、HBVとのco-infectionによる感染の慢性化阻止について条件の最適化を検討する。また、これらのmiRNA/標的mRNAがHBV生活環のどこに作用するか、どのように作用して慢性化が阻止されるかの基礎的検討を行い、最終的には申請者らが独自に作製したヒト化肝臓キメラマウスモデルを用いたin vivo実験系でHBV感染の慢性化阻止の検討を行いたいと考えている。加えて、各々のmiRNA/標的mRNA のknockdown/overexpression時の細胞内遺伝子変化を網羅的に解析することも考えている。
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| Causes of Carryover |
初年度の内容を継続して、再現性や妥当性を吟味、さらに発展させる。初年度は以前から続けていた関連する研究や他の研究課題で使用していた消耗品や実験系もあり、結果的に当該研究費の使用が抑えられた。しかし、上記に記載した通り、次年度は研究をより発展させるために研究費のほとんどが消耗品に費やされる。特にベクター系やin vitroに用いる初代肝細胞が多くを占めると考えられる。
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Research Products
(19 results)
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[Journal Article] Comparative assessment of sarcopenia using the JSH, AWGS, and EWGSOP2 criteria and the relationship between sarcopenia, osteoporosis, and osteosarcopenia in patients with liver cirrhosis2019
Author(s)
Saeki C, Takano K, Oikawa T, Aoki Y, Kanai T, Takakura K, Nakano M, Torisu Y, Sasaki N, Abo M, Matsuura T, Tsubota A, Saruta M
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Journal Title
BMC Musculoskelet Disord
Volume: 20
Pages: 615
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Factors influencing subclinical atherosclerosis in patients with biopsy-proven nonalcoholic fatty liver disease2019
Author(s)
Arai T, Atsukawa M, Tsubota A, Kawano T, Koeda M, Yoshida Y, Tanabe T, Okubo T, Hayama K, Iwashita A, Itokawa N, Kondo C, Kaneko K, Kawamoto C, Hatori T, Emoto N, Iio E, Tanaka Y, Iwakiri K
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Journal Title
PLoS One
Volume: 14
Pages: e0224184
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] The efficacy and safety of glecaprevir plus pibrentasvir in 141 patients with severe renal impairment: a prospective, multicenter study2019
Author(s)
Atsukawa M, Tsubota A, Toyoda H, Takaguchi K, Nakamuta M, Watanabe T, Michitaka K, Ikegami T, Nozaki A, Uojima H, Fukunishi S, Genda T, Abe H, Hotta N, Tsuji K, Ogawa C, Tachi Y, Shima T, Shimada N, Kondo C, Akahane T, Aizawa Y, Tanaka Y, Kumada T, Iwakiri K
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Journal Title
Aliment Pharmacol Ther
Volume: 49
Pages: 1230-1241
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Association of vitamin D levels and vitamin D-related gene polymorphisms with liver fibrosis in patients with biopsy-proven nonalcoholic fatty liver disease2019
Author(s)
Arai T, Atsukawa M, Tsubota A, Koeda M, Yoshida Y, Okubo T, Nakagawa A, Itokawa N, Kondo C, Nakatsuka K, Masu T, Kato K, Shimada N, Hatori T, Emoto N, Kage M, Iwakiri K
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Journal Title
Dig Liver Dis
Volume: 51
Pages: 1036-1042
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Efficacy and safety of ombitasvir/paritaprevir/ritonavir and ribavirin for chronic hepatitis patients infected with genotype 2a in Japan2019
Author(s)
Atsukawa M, Tsubota A, Toyoda H, Takaguchi K, Nakamuta M, Watanabe T, Tada T, Tsutsui A, Ikeda H, Abe H, Kato K, Uojima H, Ikegami T, Asano T, Kondo C, Koeda M, Okubo T, Arai T, Iwashita-Nakagawa A, Itokawa N, Kumada T, Iwakiri K
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Journal Title
Hepatol Res
Volume: 49
Pages: 369-376
DOI
Peer Reviewed
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[Presentation] NAFLD患者のvitamin D代謝の特徴～vitamin D介入試験の結果も含めて～2019
Author(s)
河野惟道, 厚川正則, 肥田 舞, 吉田祐士, 大久保知美, 新井泰央, 岩下 愛, 糸川典夫, 近藤千紗, 加藤慶三, 島田紀朋, 坪田昭人, 岩切勝彦
Organizer
第55回日本肝臓学会総会
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[Presentation] C型肝炎に対するダクラタスビル・アスナプレビルの肝障害に関連する遺伝子多型の検討2019
Author(s)
加藤慶三, 安部 宏, 厚川正則, 島田紀朋, 井家麻紀子, 清水晶平, 塙 紀子, 米澤 健, 遠藤慎治, 松尾亮太, 坪田昭人
Organizer
第55回日本肝臓学会総会
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[Presentation] 当院におけるHIV/HCV重複感染例に対するDAA治療2019
Author(s)
中野真範, 及川恒一, 木下勇次, 木下千夏, 富田陽一, 高野啓子, 石田仁也, 高倉一樹, 鳥巣勇一, 石川智久, 猿田雅之, 坪田昭人, 李 広烈, 保科斉生, 清水昭宏, 吉田正樹, 堀 誠治
Organizer
第61回日本消化器病学会大会
