2019 Fiscal Year Research-status Report
シクロスポリン誘導体を基盤とした新規インフルエンザウイルス増殖関連因子の解明
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19K08962
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| Research Institution | Juntendo University |
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Principal Investigator |
山本 典生 順天堂大学, 医学部, 准教授 (40323703)
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2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | インフルエンザウイルス / シクロスポリン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
インフルエンザは、人類が警戒しなければならない感染症の１つである。毎年の季節性インフルエンザの流行に加え、高病原性鳥インフルエンザA(H5N1)ウイルスや鳥インフルエンザA(H7N9)ウイルスのヒトへの感染が報告されており、これらから新型インフルエンザウイルスが出現することが危惧されている。インフルエンザウイルスは変異しやすく、薬剤耐性ウイルスが容易に出現するという問題があるため、新たな機序によるウイルス増殖阻害剤の開発が求められている。
新しいウイルス増殖阻害剤の探索のためにスクリーニングを行なったところ、シクロスポリンA（CsA）が同定された。CsAの既知の標的分子についてRNAiによるノックダウン解析を行ったところ、いずれもウイルス増殖過程には関与していないことが明らかとなった。そこで、新たな宿主因子がCsAによるウイルス増殖阻害に関与しているとの仮説を立て、CsA固定化ビーズを用いたプルダウン法による新規宿主因子の同定を試みた。その結果、SDS-PAGEによって明らかなバンドが複数得られた。それらを質量分析装置で解析したところ、これまでにCsAへの結合が報告されていない新たなタンパク質が検出された。さらに、質量分析実験の解析結果が正しいことを確認するため、ウエスタンブロットを実施した。その結果、複数のタンパク質において、特異的抗体によりCsAへの結合が確認できた。現在、確認できたタンパク質についてゲノム編集によるノックアウト細胞の構築を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
CsA固定化ビーズによるプルダウン法と質量分析実験によって、新規のCsA結合タンパク質候補を同定し、それらが正しい結果であることをウエスタンブロット法によって確認できたことから、研究は概ね順調に進んでいると言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
CsA固定化ビーズによるプルダウン法、質量分析実験、ウエスタンブロット法によって確認されたタンパク質について、ゲノム編集技術によりA549細胞から削除する。得られた標的遺伝子ノックアウトA549細胞とコントロールA549細胞を用いて、インフルエンザウイルスの感染実験を行い、ウイルスの増殖を比較する。ノックアウトによりウイルス増殖量が変化するタンパク質を特定できたら、その細胞タンパク質とウイルスタンパク質の相互作用について検証する。
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| Causes of Carryover |
令和１年度は、COVID-19の流行とそれに対する対応、及び研究代表者の異動のため、本研究に関する実験の実施が困難になる状況が生じた。そのため、ノックアウト細胞の作成など一部の実験を令和２年度に行うこととした。実験計画をこのように変更したため、次年度使用が生じた。
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