2020 Fiscal Year Research-status Report
シクロスポリン誘導体を基盤とした新規インフルエンザウイルス増殖関連因子の解明
| Project/Area Number |
19K08962
|
|---|
| Research Institution | Tokai University |
|---|
Principal Investigator |
山本 典生 東海大学, 医学部, 教授 (40323703)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
|
| Keywords | インフルエンザウイルス / シクロスポリン / 宿主因子 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
我々が警戒しなければならない感染症の１つとして、インフルエンザがある。季節性インフルエンザは毎年世界的な流行を起こしている。さらに、高病原性鳥インフルエンザA(H5N1)ウイルスや鳥インフルエンザA(H7N9)ウイルスのヒトへの感染が報告されており、これらから新型インフルエンザウイルスが出現することが危惧されている。インフルエンザウイルスは変異しやすく、薬剤耐性ウイルスが容易に出現するという問題があるため、新たな機序によるウイルス増殖阻害剤の開発が求められている。
新しい抗ウイルス薬の探索のためにスクリーニングを行なったところ、シクロスポリン（CsA）がヒットしたため、CsAの既知の標的分子についてRNAiによるノックダウン解析を行った。しかしいずれもウイルス増殖過程には関与していないことが明らかとなった。そこで、新たな宿主因子がCsAによるウイルス増殖阻害に関与していると考え、CsA固定化ビーズを用いたプルダウン法による新規宿主因子の探索を行なった。SDS-PAGEによって得られたバンドを質量分析装置で解析したところ、これまでにCsAへの結合が報告されていない新たなタンパク質が検出された。さらに、質量分析実験の解析結果が正しいことを確認するため、ウエスタンブロットを実施した。その結果、複数のタンパク質において、特異的抗体によりCsAへの結合が確認できた。続いて、確認できたタンパク質について、ゲノム編集によるノックアウト細胞の構築を行なった。少なくとも複数の標的タンパク質について、ノックアウトが成功したと思われる細胞を取得することができた。遺伝子ノックアウトがウイルスの増殖効率に与える影響について検討を行ったところ、ある宿主因子がウイルス増殖過程に関与することが示唆された。今後は、ノックアウト細胞の幅を広げるとともに、再現性について確認を進める予定である。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
CsA固定化ビーズによるプルダウン法と質量分析実験によって、新規のCsA結合タンパク質候補を同定し、それらが正しい結果であることをウエスタンブロット法によって確認した。その結果に基づいてノックアウト細胞の構築を行ない、ウイルス増殖に関与する宿主因子が見えつつあるが、全ての標的についてのノックアウト細胞構築はまだ完了していない。先に同定された増殖関連宿主因子候補については次段階の解析を進めながら、遺伝子ノックアウトも進展させる。
|
| Strategy for Future Research Activity |
CsA固定化ビーズによるプルダウン法、質量分析実験、ウエスタンブロット法によって確認されたタンパク質について、ゲノム編集技術によりA549細胞からノックアウトを行なって来たが、未完了の標的についてさらにノックアウト細胞の構築を進める。得られた標的遺伝子ノックアウトA549細胞とコントロールA549細胞を用いて、インフルエンザウイルスの感染実験を行い、ウイルスの増殖を比較する。ノックアウトによりウイルス増殖量が変化するタンパク質を特定できたら、その細胞タンパク質とウイルスタンパク質の相互作用について免疫沈降法等により検証する。さらに、CsA誘導体を用いた抗ウイルス活性の評価も行う予定である。
|
| Causes of Carryover |
令和2年度は、COVID-19の流行とそれに対する対応、及び研究代表者の異動直後で研究環境が整っていなかったこともあり、本研究に関する実験の実施が困難になる状況が生じた。そのため、タンパク質の相互作用解析や、まだ作成が完了していないノックアウト細胞の構築については令和3年度に行うこととした。実験計画をこのように変更したため、次年度使用が生じた。
|
