2020 Fiscal Year Research-status Report

Elucidation of PPY cell lineage for development of new beta cell origin

Research Project

Project/Area Number	19K08984
Research Institution	Saitama Medical University
Principal Investigator	原朱美埼玉医科大学, 医学部, 非常勤講師 (60570009)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	藤谷与士夫群馬大学, 生体調節研究所, 教授 (30433783) 中尾啓子埼玉医科大学, 医学部, 講師 (70338185)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2022-03-31
Keywords	β細胞 / α細胞 / PP細胞 / 分化転換 / Vβ細胞 / 糖尿病 / Pdx1
Outline of Annual Research Achievements	我々は、これまでの2型糖尿病モデルである高脂肪食+ストレプトゾトシン負荷マウスにおいて、特に膵島辺縁領域の細胞で、β細胞からα細胞あるいはPP細胞への分化転換が盛んに起きていることを発見しており、この結果から膵島辺縁領域の細胞には可塑性が高い細胞集団が存在するのではないかと考えた。膵島辺縁領域の細胞に関しては、2017年にVan der Meulenらによって、Virgin β (Vβ)細胞と呼ばれる未成熟なβ細胞の存在が報告されている。そこで、我々が独自に確立した辺縁部のVβ細胞特異的に遺伝子導入可能な電気穿孔法 (論文投稿準備中)により、RIP-CreプラスミドベクターをRosa26-YFPマウスの膵臓に導入することによって、辺縁部のVβ細胞を選択的に標識して系譜を追跡した。その結果、膵島辺縁部に存在するVβ細胞が、時間経過と共に膵島中核部を構成する成熟したβ細胞に分化することを示唆する結果を得た。さらに、Rosa26-YFPとPdx1-floxの両遺伝子を保有するマウスの膵臓に、同じRip-Creプラスミドを電気穿孔法で導入し、Pdx1の発現を低下または欠失させると、β細胞の減少と同時にα細胞（膵尾部 (sp)の場合）またはPP 細胞（膵頭部 (duo)の場合）の増加が見られ、Vβ細胞からα細胞（膵尾部 (sp)の場合）またはPP 細胞（膵頭部 (duo)の場合）への分化が示唆された。Pdx1は糖尿病モデルマウスの膵臓でも発現が低下することが我々の研究でも明らかになっており、高血糖　And/Or　Pdx1 の発現低下がVβ細胞からα細胞またはPP 細胞へ分化させる可能性が示唆された。この結果から、膵領域特異的に起きている未分化β細胞から、α細胞、PP細胞への分化転換は、Pdx1より上流の遺伝子 (Factor X)によって制御されている可能性が示唆された。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 我々が独自に確立した膵臓の電気穿孔法を用いることにより、膵島辺縁領域のVβ細胞特異的な分化転換に着目し、結果が得られたことは、本研究課題遂行において画期的な進展である。さらに電気穿孔法については、現在、論文投稿準備中である。
Strategy for Future Research Activity	我々は、膵島辺縁部に存在するUrocortin3, Glut2を発現していない未熟なβ細胞を膵島HUB細胞(旧virgin β細胞)と呼ぶ。そして、これまでの検討において、それらの膵島HUB細胞が膵島中央部に存在する成熟したβ細胞ヘ分化することを見いだしている。そこで、今後は、膵島HUB細胞未分化性の維持と成熟したβ細胞への分化のバランスを決めているのは何か？を明らかにするために、①高脂肪食負荷+/-STZ負荷を掛けて高血糖にした場合、②成熟したβ細胞と比べて膵臓HUB細胞の方で高い発現を示す転写因子MafBやNeurog3の発現を下げた場合、③成熟したβ細胞と比べて膵島HUB細胞の方で低い発現を示す転写因子Pdx1,Nkx6-1,Insm1,Mnx1,Neurod1, Pax6, MafA等の遺伝子の発現を上げた場合、膵臓HUB細胞がどのような分化状態になるのかを解析することによって、膵臓HUB細胞の分化を制御するメカニズムを明らかにする。次に、④膵島HUB細胞（旧Virgin β細胞）及び、それと隣接するKi67陽性のUrocortin3を発現するβ細胞の細胞分裂能及び細胞周期を解析するため、in vivoでBrdU とEdU標識する事により細胞分裂能と細胞周期をin vivoで明らかにする。当初の実験方法である遺伝子組み換えマウスを用いた解析では、糖尿病モデルマウスの生理的変化による各遺伝子への影響や、遺伝子改変モデルマウスでは、目的の遺伝子を発現する全細胞で遺伝子を変異させてしまうなど多くの問題があると考え、それを解決するため、膵臓の電気穿孔法と導入遺伝子を追跡するためのリアルタイム三次元連続観察法を開発・確立するに至った。この方法を用いることにより、真のβ細胞の分化転換制御機構を解明できると考えている。
Causes of Carryover	当該年度に使用するため購入予定であった細胞生物学的研究用試薬を、試薬の使用量が予定より少量であったため、次年度に購入することとなった。