2019 Fiscal Year Research-status Report
トランス脂肪酸が細胞膜の機能を変化させる仕組みの解明
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19K08989
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| Research Institution | Tokyo University of Pharmacy and Life Science |
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Principal Investigator |
袴田 秀樹 東京薬科大学, 薬学部, 教授 (70284750)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | トランス脂肪酸 / 低比重リポタンパク質 / 高比重リポタンパク質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
トランス脂肪酸は、アメリカ食品医薬品局（FDA）による部分水素添加油脂の使用規制の発表を契機として、一般に注目されるようになった。それまでに、トランス脂肪酸に関する多くの研究が行われており、その作用は多岐に亘ること、更に複合的に動脈硬化性の疾患を促進することなどが示されていた。本研究では、トランス脂肪酸の多様な作用のうち、細胞膜の組成と機能に与える影響に焦点を当て、リポタンパク質代謝の変化を説明することを目的としている。具体的には、トランス脂肪酸が細胞膜に取り込まれると、シス型の脂肪酸が取り込まれるよりは膜が硬くなり、低比重リポタンパク質の細胞への取り込みや高比重リポタンパク質の新生が起こりにくくなる、という仮説を設定し、研究に取り組んでいる。
2019年度は、低比重リポタンパク質の細胞取り込みに対するトランス脂肪酸の効果を検討するための基礎研究を進めた。当初は、ヒト肝がん由来HepG2細胞にDiI-LDLとDiO-LDLを作用させ、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）を利用する低比重リポタンパク質の細胞取り込みの評価を行う予定であった。しかし、Operetta CLS High-Content Analysis Systemを用いて実験してみると、細胞内外の低比重リポタンパク質の判別が困難であり、また、FRETによる発光が弱く、細胞取り込みを観察するには不十分な実験系であることが分かった。そこで、中性（pH7付近）ではほとんど蛍光を発しないが、弱酸性で蛍光強度が増加するpHrodo Red LDLの利用を発案し、HepG2細胞を用いる細胞実験を行った。その結果、低比重リポタンパク質の細胞取り込みの濃度依存性、並びに過剰の非標識低比重リポタンパク質による抑制（特異的な細胞取り込み）を観察することができ、細胞取り込みを評価する実験系を構築することができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
試行錯誤はあったが、概ね計画通りに進行している。研究成果の概要で述べたように、低比重リポタンパク質の細胞取り込みを評価するための実験系を構築できており、当初の計画をそのまま推進すればよいと判断している。
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| Strategy for Future Research Activity |
2020年度は、前年度に構築した細胞実験系を、トランス脂肪酸の効果の評価へと適用する。HepG2細胞を、種々の脂肪酸と保温して取り込ませた後、細胞を洗浄し、pHrodo Red LDL（pH感受性の蛍光官能基で標識した低比重リポタンパク質）と反応させる。前処置に用いる脂肪酸は、シス型の不飽和脂肪酸であるオレイン酸、cis-バクセン酸、トランス脂肪酸のエライジン酸、バクセン酸、飽和脂肪酸のステアリン酸である。培養の実験条件を変化させ、その細胞取り込みをOperetta CLS High-Content Analysis Systemを用いて観察する。
マクロファージからの高比重リポタンパク質新生に関しては、2019年度に予備検討を開始した。酵素法によるコレステロールの高感度定量法を適用し、放射標識コレステロールを使用せずに、マウスマクロファージ系RAW264.7細胞からのアポ蛋白A-1によるコレステロール引き抜きを観察できるかどうか、検討中である。コレステロール引き抜きの培養条件を確立した後、培地から脂質分画を調製し、ホスファチジルコリンを標的とするターゲットリピドミクス解析を行う。分析機器として、液体クロマトグラフィー-イオントラップ飛行時間型質量分析計を利用する予定であったが、2019年度に共同機器として液体クロマトグラフィー-四重極飛行時間型質量分析計が導入されたため、後者の利用も検討する。
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Research Products
(1 results)
