2020 Fiscal Year Research-status Report
Functional analysis of neuropeptide Y-expressing neurons using Cre/LoxP system
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19K09032
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| Research Institution | Kyoto Prefectural University of Medicine |
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Principal Investigator |
山田 俊児 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (40454079)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | ニューロペプチドY / Cre-loxP / アデノ随伴ウイルス / 側坐核 / 外側基底扁桃体 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
視床下部弓状核（ARC）に局在するニューロペプチドY（NPY）発現ニューロンは摂食を強力に促進する神経ペプチドである。そのため，受容体のアンタゴニストは抗肥満薬として開発が進んでいる。一方で、NPY発現ニューロンは脳内に広く分布し様々な機能に関連すると考えられているため、副作用について考える上でNPY発現ニューロンの機能を把握しておく必要がある。これまでに、申請者らは側坐核（NAc）に局在するNPY発現ニューロンが不安行動に関わることを明らかにした。
NAcにはNPY発現ニューロンの細胞体も多いが、神経線維も多く見られた。そこで、当該年度では、逆行性のアデノ随伴ウイルス（AAV）を合成し、NAcに投射するNPY発現ニューロンの起始核を調べた。その結果、外側基底扁桃体（BLA）と前障に存在するNPY発現ニューロンがNAcに投射していることが明らかとなった。
同様の方法を用いて、視床下部においてNPY発現線維が多く見られる室傍核や外側視床下部（LH）にAAVを投与したが、逆行性に標識される細胞を確認することができなかった。逆行性AAVは視床下部のニューロンには感染しにくいという報告があったので、組換え狂犬病ウイルスを用いた別の逆行性ラベリングを試したところ、NAcのNPY発現ニューロンがLHに投射することを明らかとなった。逆行性ラベリングで明らかになった神経投射をより確実にするために、順行性のAAV-FLEX-GFPを作製し、NPY-CreマウスのNAcに投与したところ、GFP陽性の神経終末がLHに見られた。これらのことから、NAcのNPYニューロンはLHに投射することが明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
脳内におけるNPY発現をNPY-Creマウスとアデノ随伴ウイルスにより明らかにしようと考えたが、血液脳関門通過性のAAV（AAV PHP.B）を作製するプラスミドの購入がコロナウイルスの影響で大幅におくれたため。
また、視床下部では一部のAAVの感染力が低いことが分かり、視床下部のNPY発現線維の起始核を明らかにするために組換え狂犬病ウイルスを用いた方法を立ち上げたが、それに時間をようしたため。
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| Strategy for Future Research Activity |
新たに明らかとなったBLAからNAcに投射するNPY発現ニューロンについて解剖学的／機能的解析を行う。NPY-CreマウスとCre依存性にカスパーゼを発現させてそのニューロンを欠損させるAAV-FLEX-Casp3を用いて、BLAのNPY発現ニューロンを欠損させたマウスを作製し、不安・うつ様行動、摂食行動、逃避行動を調べる。また、BLAのNPY発現ニューロンにチャネルロドプシンを発現させ、NAcにおいてチャネルロドプシンを発現した神経終末を刺激した時の上記の行動変化を調べ、BLAからNAcに投射するNPY発現ニューロンの機能を明らかにする。
同時に、順行性のAAVを作製し、NPY発現ニューロンがBLAからBAcに投射することやARC以外の視床下部に局在するNPY発現ニューロンの投射について、ガラスピペットを用いた局所投与により明らかにする。
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| Causes of Carryover |
コロナウイルスの影響で、輸入する予定だったプラスミドや器具の納品が遅れ、実験の進行がかなり遅くなってしまった。それに伴い消耗品の購入もかなり減らしたため次年度使用額が生じた。また予定していた学会が中止もしくはオンライン開催となったので旅費としての支出がかなり抑えられた。
プラスミドの購入は完了できたので、そのプラスミドを用いたAAVを作製するための試薬の購入や、マウスへの脳内局所投与用の実験器具の購入に使用する予定である。
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