2020 Fiscal Year Research-status Report
EDA関連分子の機能解析によるそのシステムの全容解明
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19K09037
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| Research Institution | National Center for Global Health and Medicine |
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Principal Investigator |
粟澤 元晴 国立研究開発法人国立国際医療研究センター, その他部局等, 糖尿病研究センター 分子糖尿病医学研究部 統合生理学研究室長 (90466764)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | EDA / 皮膚 / 代謝 / 血糖 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本プロジェクトにおいては無汗性外胚葉形成不全症の原因遺伝子であるEDA、およびそのイントロンに存在するmiR-676について、1, miR-676の代謝における役割の解明、2, EDAのアイソフォームの一つであるEDA-A1の代謝における意義付けを目標として挙げた。
昨年度の成果として、EDA-A1アイソフォーム特異的な受容体EDARに対する刺激型抗体を成獣マウスに投与し、高脂肪食負荷で随時血糖の有意な上昇を認めていた。このことを承けて、今回EDA-A1を肝臓において過剰発現すべく、アデノ随伴ウイルスを作成した（AAV-EDAA1）。このウイルスベクターを用い、野生型マウスの肝臓にEDA-A１を過剰発現、高脂肪食を負荷し、コントロールウイルスを投与したマウスを対照群として23週まで観察を行った。しかしながら、マウスの体重、血糖、組織重量、体温などに有意な変化は観察されなかった。また、EDAシグナルの下流としてJNKの活性化が知られているが、このJNKの筋肉における働きの糖代謝への影響を検討するために、JNK1、JNK2の筋肉特異的同時欠損マウスを作成、やはり高脂肪食を負荷し観察を行ったが、体重、血糖、組織重量、体温などに有意な変化を認めなかった。
一方で、皮膚生理の代謝に対する影響の解析を補完する目的で、マウス皮膚に血管拡張薬であるイロプロストを塗布し、マウスの熱放散を促進するモデルを確立し、イロプロストの二週間の塗布がマウスの随時血糖を低下させることを確認した。組織の遺伝子発現を検討したところ、肝臓の糖新生を担う律速酵素の一つである遺伝子G6pcが低下する一方で、Pck1, Ppargc1a遺伝子の発現が上昇していた。皮膚の代謝における位置付けをより深く掘り下げる目的で、現在皮膚のシングルセルRNA-seqを行うべく条件検討を開始している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本プロジェクトにおいては無汗性外胚葉形成不全症の原因遺伝子であるEDA、およびそのイントロンに存在するmiR-676について、1, miR-676の代謝における役割の解明、2, EDAのアイソフォームの一つであるEDA-A1の代謝における意義付けを目標として挙げた。
EDAシグナルの代謝における意義を調べるべく、複数のモデルにてその糖代謝に対する影響を検討してきたが、必ずしも一貫した結果が得られなかった。このため、より広く課題を捉え直し、皮膚の代謝における意義を明らかとする目的を掲げた。皮膚が代謝制御に関わるか否かを検討する目的でモデルの構築とパイロット解析を行い、皮膚における血管拡張が血糖値の低下を生じうる可能性が示唆され、
そのメカニズムとして肝臓の遺伝子発現の変化が関与している可能性が示唆された。これに基づき、皮膚の代謝における位置付けをより深く掘り下げる目的で、現在皮膚のシングルセルRNA-seqを行うべく条件検討を開始している。
一方１について、一般に一つ一つのmicroRNAの働きは穏やかで、かつ一つのmicroRNAが多数の標的遺伝子に作用することから、単独のmicroRNAのみに着目した解析では不十分である可能性を踏まえ、高脂肪食負荷マウス, db/dbマウスの肝臓で共通して上昇するmicroRNAをsmall RNAseqで選別した。発現上昇の程度が大きなものを10種類選別したところ、この中にはmiR-676の他、既に代謝作用が報告されているmiR-802, miR-34aなどが含まれていた。後述の通り、これらのmicroRNAを肝細胞に同時発現する系を確立すべく現在検討を行っている。
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| Strategy for Future Research Activity |
EDAに関連した研究については、その課題をより広義に捉え直し、代謝において皮膚が果たす役割を改名すべく検討を進めていく。これまでの予備検討からは、皮膚における血管拡張が血糖値の低下を生じうる可能性が示唆され、そのメカニズムとして肝臓の遺伝子発現の変化が関与している可能性が示唆されている。本モデルを追試するとともに、その際に生じる生理学的変化をより詳細に解析する目的で、代謝ケージを用いたエネルギー代謝測定、また低温環境下での作用の変化、Thermoneutralityにおける作用の消失の有無などを検討していく。さらに、皮膚の代謝における位置付けをより深く掘り下げる目的で、皮膚のシングルセルRNA-seqを行うべく条件検討を開始する。
microRNAに関連した研究については、レンチウイルスを用いた多重発現系の確立を目指す。具体的には、各microRNAを発現するレンチウイルスを MOI = 0.5で10種類、肝細胞系の培養細胞で過剰発現させると、総MOI = 5 となり平均５個／細胞のmicroRNAの感染が想定され、実際には3種類から7種類のmicroRNAが入る細胞が全体の９割を占めると推定される （特定の組み合わせでmiRが入る可能性は0.1%となる）。 これら細胞に対し、インスリンシグナル、脂肪蓄積などを蛍光で検出、蛍光シグナルの “High”と”Low”とを比較し、10種類のmicroRNAにつきRT-PCRすることで、どのmicroRNAの組み合わせが濃縮されてくるかを観察する。濃縮の見られたmicroRNAを高力化で共発現し、RNAseqによって網羅的に遺伝子発現を解析することで、複数のmicroRNAの同時作用によって初めて観察される遺伝子発現への影響を観察できることが期待される。
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