甲状腺未分化癌におけるエピジェネティクスをターゲットとした治療戦略

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K09052
• Research Institution: Yokohama City University
• Principal Investigator: 中山 博貴 横浜市立大学, 附属病院, 助教 (60438158)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 宮城 洋平 地方独立行政法人神奈川県立病院機構神奈川県立がんセンター(臨床研究所), 臨床研究所, 所長 (00254194) ; 星野 大輔 地方独立行政法人神奈川県立病院機構神奈川県立がんセンター(臨床研究所), その他部局等, 副技幹・主任研究員 (30571434) ; 菅沼 伸康 横浜市立大学, 医学研究科, 客員研究員 (40724927) ; 吉田 達也 横浜市立大学, 医学部, 助教 (70748350)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 甲状腺未分化癌 / 脱分化 / EZH2 / 甲状腺分化マーカー

Outline of Annual Research Achievements

本研究は、これまでに有効な治療法が少ない甲状腺未分化癌で EZH2 が新規治療標的となるかを検討することを目的として、以下の研究を行った。
昨年度は、甲状腺未分化癌培養細胞株 TTA1 と 8305C にレンチウイルスを用いて、EZH2 安定発現抑制株を樹立した。コントロールとして、LacZ 遺伝子に相補的な遺伝子を持つ shRNA vector を用いて、EZH2は２種類の異なるターゲット配列をそれぞれshRNA vector に組み込み、レンチウイルスを作成後、TTA1 と 8305C に感染させた。薬剤選択後、EZH2 発現抑制効果はウエスタンブロッティングで確認した。これらの細胞株を用いて、EZH2 の脱分化への関与を評価するため、リアルタイムPCRの系の確立を試みた。甲状腺分化マーカーとして報告されているNIS,TSHR,TPO,TG,Pax8,NKX2-1,DUOX1,DUOX2,DIO2,Slc26a のリアルタイム PCR の系を確立することを目指した。まず、ゲノムの巻き込みを防ぐ目的で、それぞれ intron を挟む形でプライマーを設計した。実際に、ゲノムを用いた PCR では増幅されないことを確認した。次に、遺伝子増幅産物は、アガロースゲル電気泳動後にDNAを抽出して、 T-vector にクローニングし、DNA シークエンスにより目的遺伝子であることを確認した。この T-Vector はリアルタイム PCR を行う際の検量線用スタンダード遺伝子として使用する。以上のことより、昨年度はEZH2 安定発現抑制株の樹立と１０種類の甲状腺分化マーカーのリアルタイムPCRの系を確立することができた。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

EZH2 安定発現抑制株の樹立と甲状腺分化マーカーのリアルタイムPCRの系の樹立に時間がかかったため、少し遅れている

Strategy for Future Research Activity

本年度は、昨年度樹立した EZH2 安定発現抑制株を用いて甲状腺分化マーカー遺伝子の発現量をリアルタイムPCR で確認することを目指す。さらに、TGとPax8 は病理診断用の抗体があるため、EZH2 安定発現抑制株を用いた免疫染色も行う。
甲状腺未分化癌における EZH2 の機能を評価するため、細胞増殖アッセイと細胞浸潤アッセイを行う。細胞増殖アッセイは、コントロール細胞株とEZH2 安定発現抑制株の増殖をMTT アッセイを行い比較する。次に、細胞の浸潤能をマトリゲルやコラーゲン等の細胞外マトリックスでコートしたボイデンチャンバーを用いて評価する。ボイデンチャンバーを用いた系で EZH2 依存的な浸潤能が確認された場合は、ライブセルイメージングを行うことで、EZH2 の運動能を評価する。

Causes of Carryover

研究が遅れたため、使用予定であった抗体の購入を次年度にすることとした。