Establishment of novel drug susceptibility testing and biomarker using anaplastic thyroid cancer organoid

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K09087
• Research Institution: Kanagawa Cancer Center Research Institute
• Principal Investigator: 菅沼 伸康 地方独立行政法人神奈川県立病院機構神奈川県立がんセンター(臨床研究所), その他部局等, 医長 (40724927)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 宮城 洋平 地方独立行政法人神奈川県立病院機構神奈川県立がんセンター(臨床研究所), 臨床研究所, 所長 (00254194) ; 益田 宗孝 横浜市立大学, 医学研究科, 教授 (10190365) ; 星野 大輔 地方独立行政法人神奈川県立病院機構神奈川県立がんセンター(臨床研究所), その他部局等, 副技幹・主任研究員 (30571434) ; 利野 靖 横浜市立大学, 附属病院, 准教授 (50254206) ; 中山 博貴 横浜市立大学, 附属病院, 助教 (60438158) ; 吉田 達也 横浜市立大学, 医学部, 助教 (70748350)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: オルガノイド / 甲状腺癌

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、これまでに有効な治療法が確立されていない甲状腺未分化癌のプレシジョンメディシン実現に向けて、患者由来腫瘍オルガノイド (Patient derived organoid; PDO) を用いることにより、短期間での薬剤感受性予測方法の確立と各薬剤の感受性バイオマーカーの同定を目的としている。その手順として、1) PDOの作製、2) 薬剤感受性評価系の確立と臨床結果との比較、3) セレクト―ム解析とマーカー分子の同定、をかかげ、研究計画をたてた。
初年度は、いまだ確立されていない甲状腺未分化癌の樹立を目標として研究を進めた。神奈川県立がんセンターと共同研究2施設において診断・採取された甲状腺未分化癌より、Sachs らが報告した方法 (Sachs et al. Cell 2018) を基準として、甲状腺癌のオルガノイドに適した条件設定を行った。また、甲状腺未分化癌としての生物学的特徴を有しているかどうかを確認するためには、甲状腺分化癌を中心とした他の組織型の甲状腺癌や正常甲状腺組織との比較が重要となる。このため、甲状腺未分化癌以外に、正常甲状腺組織や他の組織型の甲状腺癌のオルガノイド作成も行った。その結果、現在までに甲状腺未分化癌オルガノイド5株と、甲状腺癌並びに甲状腺正常組織のオルガノイドを作製することができた。これらのオルガノイドに対して、サイログロブリンやPax8、TSH受容体などの分化マーカーの発現評価を行い、それぞれの組織型において特徴を維持した結果を得た。
今年度は、確立した上記方法でオルガノイドの樹立を継続するとともに、薬剤感受性評価系の確立に関する研究を開始する予定である。その後、薬剤奏功患者由来 PDOと薬剤耐性患者由来 PDO の分泌タンパク質を、下記方法によるセクレトーム解析で網羅的な検討を行い、薬剤感受性予測マーカーの同定を目指す。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究では、これまでに有効な治療法が確立されていない甲状腺未分化癌のプレシジョンメディシン実現に向けて、患者由来腫瘍オルガノイド (Patient derived organoid; PDO) を用いることにより、短期間での薬剤感受性予測方法の確立と各薬剤の感受性バイオマーカーの同定を目的としている。その手順として、1) PDOの作製、2) 薬剤感受性評価系の確立と臨床結果との比較、3) セレクト―ム解析とマーカー分子の同定、をかかげ、研究計画をたてた。
初年度は、いまだ確立されていない甲状腺未分化癌の樹立を目標として研究を進めた。神奈川県立がんセンターと共同研究2施設 (横浜市立大学附属病院、横浜市立大学附属市民総合医療センター) において診断・採取された甲状腺未分化癌より、Sachs らが報告した方法 (Sachs et al. Cell 2018) を基準として、甲状腺癌のオルガノイドに適した条件設定を行った。また、甲状腺未分化癌としての生物学的特徴を有しているかどうかを確認するためには、甲状腺分化癌を中心とした他の組織型の甲状腺癌や正常甲状腺組織との比較が重要となる。このため、甲状腺未分化癌以外に、正常甲状腺組織や他の組織型の甲状腺癌のオルガノイド作成も行った。その結果、現在までに甲状腺未分化癌オルガノイド5株と、甲状腺癌並びに甲状腺正常組織のオルガノイドを作製することができた。これらのオルガノイドに対して、サイログロブリンやPax8、TSH受容体などの分化マーカーの発現評価を行い、それぞれの組織型において特徴を維持した結果を得ることができた。

Strategy for Future Research Activity

2021年度は、確立した上記方法で甲状腺未分化癌を中心としたオルガノイドの樹立を継続するとともに、薬剤感受性評価系の確立に関する研究を開始する予定である。具体的には、in vitro での薬剤感受性評価として、PDO 培地中に異なる濃度の薬剤を添加し、IC 50 を算出する。また、in vivo での薬剤感受性評価として、PDO をヌードマウスの皮下に移植し、1週間後から、対象薬剤を３日毎に尾静脈投与し、腫瘍の大きさを記録する。こうして得られた結果と臨床結果を比較検討して、薬剤感受性評価系の確立を目指す。これらの評価系の確立には、発症からごく短期間で致死的状況に至る甲状腺未分化癌の臨床的特徴を考慮して、短期間で判定可能なことが必須となる。そこで樹立したオルガノイドを用いて腫瘍を増殖させ、短期間で結果が得られるような評価系の確立を目指す。
その後、薬剤奏功患者由来 PDO (PDO-S) と薬剤耐性患者由来 PDO (PDO-IS) の分泌タンパク質を、下記方法によるセクレトーム解析で網羅的な検討を行い、薬剤感受性予測マーカーの同定を目指す。
・定量プロテオミクス解析；PDO-S と PDO-IS を、血清を含まない培地で2日間培養後の培地を回収し、定量プロテオミクス解析 (iTraq) により網羅的かつ定量的に両者の違いを明らかにする。
・定量プロテオミクス解析で得られたデータの数理モデル解析;浸潤ネットワークモデルとキーパス解析を拡張し、定量プロテオミクス解析で得られたデータからマーカー分子の有望な候補を効率的に抽出する。
・甲状腺未分化癌患者血清を用いた薬剤感受性予測マーカーの検討;生検時に同時に取得、保存した患者血清を用いて、血液中の薬剤感受性予測マーカーの量を ELISA によって定量し、臨床結果と比較検討する。

Causes of Carryover

初年度は、いまだ確立されていない甲状腺未分化癌の樹立を目標として研究を進めたが、本研究を介するにあたりPreliminaryに行っていた研究機器が使用できたため、当初の予定額よりもかなり物品費を抑えることができた。また、本研究開始当初は検体の収集に滞ることがあり、検体数が伸びない時期があったが、その後の改善により年度末には検体数を増やすことができた。このため、今年度分の物品費は少なかったが、来年度にその費用を持ち越すこととした。