Establishment of novel drug susceptibility testing and biomarker using anaplastic thyroid cancer organoid

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K09087
• Research Institution: Yokohama City University
• Principal Investigator: 菅沼 伸康 横浜市立大学, 医学部, 講師 (40724927)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 宮城 洋平 地方独立行政法人神奈川県立病院機構神奈川県立がんセンター(臨床研究所), 臨床研究所, 所長 (00254194) ; 益田 宗孝 横浜市立大学, 医学研究科, 教授 (10190365) ; 星野 大輔 地方独立行政法人神奈川県立病院機構神奈川県立がんセンター(臨床研究所), その他部局等, 部長代理 (30571434) ; 利野 靖 横浜市立大学, 附属病院, 准教授 (50254206) ; 中山 博貴 横浜市立大学, 医学研究科, 客員講師 (60438158) ; 吉田 達也 横浜市立大学, 附属病院, 助教 (70748350)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: オルガノイド / 甲状腺癌

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、これまでに有効な治療法が確立されていない甲状腺未分化癌のプレシジョンメディシン実現に向けて、患者由来腫瘍オルガノイド (Patient derived organoid; PDO) を用いることにより、短期間での薬剤感受性予測方法の確立と各薬剤の感受性バイオマーカーの同定を目的としている。その手順として、1) PDOの作製、2) 薬剤感受性評価系の確立と臨床結果との比較、3) セレクト―ム解析とマーカー分子の同定、をかかげ、研究計画をたてた。
2019年度は、いまだ確立されていない甲状腺未分化癌の樹立を目標として研究を進めた。神奈川県立がんセンターと共同研究2施設において診断・採取された甲状腺未分化癌より、Sachs らが報告した方法 (Sachs et al. Cell 2018) を基準として、甲状腺癌のオルガノイドに適した条件設定を行った。また、甲状腺未分化癌としての生物学的特徴を有しているかどうかを確認するためには、甲状腺分化癌を中心とした他の組織型の甲状腺癌や正常甲状腺組織との比較が重要となるため、正常甲状腺や良悪性含めた様々な甲状腺腫瘍のオルガノイド作成を試行し、これに成功した。
2020年度は、確立した上記方法で正常甲状腺、甲状腺良悪性腫瘍のオルガノイド株を高い樹立率で作成することができるようになり、培養株のストックを増やすことができた。また、レンバチニブなどの一部薬剤において薬剤感受性試験を行いIC50の設定や、薬剤治療前後での様々な因子の変化を確認した。
今年度は、引き続き、上記オルガノイド株作成ならびに薬剤感受性試験を継続していくとともに、セクレトーム解析等を用いた薬剤使用前後における様々な因子の変化を網羅的に検討し、薬剤感受性予測マーカーの同定を目指す。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

本研究では、これまでに有効な治療法が確立されていない甲状腺未分化癌のプレシジョンメディシン実現に向けて、患者由来腫瘍オルガノイド (Patient derived organoid; PDO) を用いることにより、短期間での薬剤感受性予測方法の確立と各薬剤の感受性バイオマーカーの同定を目的としている。その手順として、1) PDOの作製、2) 薬剤感受性評価系の確立と臨床結果との比較、3) セレクト―ム解析とマーカー分子の同定、をかかげ、研究計画をたてた。
2019年度は、Sachs らが報告した方法 (Sachs et al. Cell 2018) を基準として、甲状腺癌のオルガノイドに適した条件設定を行い、高い樹立率でオルガノイドを作製することが可能になった。
2020年度は、確立した上記方法で様々な甲状腺オルガノイド作成とともに、薬剤感受性評価系の確立に関する研究を行った。現在、RAI不応性進行再発甲状腺癌に対して保険適応となっている薬剤を中心に、IC 50 を算出し、薬剤使用前後での様々な因子の発現解析を行った。
上記内容に関してはおおむね順調に経過しているが、甲状腺未分化癌の新規症例が得られず、症例数が少ないままであることからその解析が遅れている。
また、PDO をヌードマウスの皮下に移植する vivo の実験では、オルガノイドの成長が遅く、現在のところかなりの時間を要することが判明した。このため、樹立したオルガノイドを用いて腫瘍を増殖させ、短期間で結果が得られるような評価系の確立を目指すためには、さらなる改良を要することとなり、条件設定等の見直しのために当初の予定よりやや遅れている。

Strategy for Future Research Activity

今年度は、上記で問題となっている甲状腺未分化癌の症例の収集を、共同研究を行っている神奈川県立がんセンター、横浜市立大学附属病院、横浜市立大学附属市民総合医療センターでの周知を再度徹底していくとともに、In vivo での条件設定を再考し短期間で結果が得られるような薬剤感受性評価系の確立を目指す。
その後、薬剤奏功患者由来 PDO (PDO-S) と薬剤耐性患者由来 PDO (PDO-IS) の分泌タンパク質を、下記方法によるセクレトーム解析で網羅的な検討を行い、薬剤感受性予測マーカーの同定を目指す。
・定量プロテオミクス解析；PDO-S と PDO-IS を、血清を含まない培地で2日間培養後の培地を回収し、定量プロテオミクス解析 (iTraq) により網羅的かつ定量的に両者の違いを明らかにする。
・定量プロテオミクス解析で得られたデータの数理モデル解析;浸潤ネットワークモデルとキーパス解析を拡張し、定量プロテオミクス解析で得られたデータからマーカー分子の有望な候補を効率的に抽出する。
・甲状腺未分化癌患者血清を用いた薬剤感受性予測マーカーの検討;生検時に同時に取得、保存した患者血清を用いて、血液中の薬剤感受性予測マーカーの量をELISA によって定量し、臨床結果と比較検討する。

Causes of Carryover

初年度は、いまだ確立されていない甲状腺未分化癌の樹立を目標として研究を進めたが、本研究を介するにあたりPreliminaryに行っていた研究機器が使用できたため、当初の予定額よりもかなり物品費を抑えることができた。また、本研究開始当初は検体の収集に滞ることがあり、検体数が伸びない時期があったが、その後の改善により年度末には検体数を増やすことができた。このため、昨年度に余剰分を持ち越した。
昨年度は、初年度の持ち越し費用があったため、今年度にさらに持ち越しとなったが、昨年度末に使用機器の修理や修理不能な故障が生じたため、今年度はその補填をふくめて使用してゆく予定である。