2020 Fiscal Year Research-status Report

Nrf2を介した間葉系幹細胞から肝細胞への分化誘導法の開発

Research Project

Project/Area Number	19K09094
Research Institution	The University of Tokushima
Principal Investigator	高須千絵徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(医学域), 講師 (70582823)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	齋藤裕徳島大学, 病院, 特任助教 (50548675) 森根裕二徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(医学域), 准教授 (60398021)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2022-03-31
Keywords	Nrf2 / HCLC
Outline of Annual Research Achievements	H31-R2:MSCからのHLC分化誘導protocolの確立【2D culture】①3-stepで2D cultureでのADSCの分化の確認。Morphology：顕微鏡にて培養6日目：胚体内胚葉（DE）細胞、培養11日目：肝芽（HE）細胞、培養21日目：肝細胞様細胞(hepatocyte-like cell = HLC)のstepにおけるmorphologic changeを確認できた。②培養5日目の細胞においてStemness genes である OCT4, SOX2の発現は低下し、endoderm cell markerのSOX17、AFP、ALBの上昇を確認した。③培養11日目から21日目において、CYP3A4 luciferase activityは著明に増加し、アルブミン分泌能、アンモニア代謝能が保持されていることを確認した。【3D culture: cell saicを用いて培養】①Morphology：顕微鏡にて培養6日目：胚体内胚葉（DE）細胞、培養11日目：肝芽（HE）細胞、培養21日目：肝細胞様細胞(hepatocyte-like cell = HLC)のstepにおけるmorphologic changeを確認。②培養5日目の細胞においてStemness genes である OCT4, SOX2の発現は低下し、endoderm cell markerのSOX17、AFP、ALBの上昇を確認した。③培養11日目から21日目において、CYP3A4 luciferase activityは著明に増加し、アルブミン分泌能、アンモニア代謝能が保持されていることを確認した。アルブミン分泌能、アンモニア代謝能は2D培養に比し、3D培養の方が機能が高いことを確認した。【R2】HLC分化におけるNrf2の役割の解明【各STEPにおけるNrf2発現の比較】IFを用いて、Nrf2のtranslocationを評価した。STEP2において、著明なNrf2の活性化（translocation）を認めた。3D HLCでは2Dほどの明らかなtranslocationは認めなかった。染色強度(Nrf2の細胞質への発現)については、STEP1<STEP2<STEP３で増強あり。2DHLCでsiNrf2では、HLC分化までの期間は通常の21日ではなく、24日要した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason H31-R2において MSCからのHLC分化誘導protocolを確立し、さらに2Dと3D培養における分化能、機能について確認をおこなった。DMFによるNrf2 activateに先行して、HLC分化におけるNrf2発現の役割につきR2は解明した。今後Nrf2 activateやcancelした場合における分化誘導につき検討をすすめていく予定である。
Strategy for Future Research Activity	1) Balb/cマウスの皮下より採取された脂肪組織から採取したADSCを用いてHLCの分化誘導を行う 2) Nrf2 cancelによるHLC作成の表評価 3）DMFによるHLC分化誘導促進に関する検討確立したprotocolの各stepにDMFを加え、作成効率改善の検討を行う。Step1/2、2/3、1/3、そして全てのstepで投与を行い比較検討する。その後最も効率が良いprotocolにおいて、3D cultureを行い作成効率の検討を行う。 4）分化誘導されたHLCのマウスモデルへの移植 Hand-pickingしたHLC をCCL4肝障害マウスモデルへ経門脈的に移植し、肝障害の改善の程度、アンモニア代謝能につき検討を行う。DMF非投与HLC群（protocol 1）使用）、DMF投与HLC群（protocol 2）使用）、3D culture HLC群（protocol 3）使用）で比較検討を行う。