2019 Fiscal Year Research-status Report

mTOR inhibitor in combination with hypoxia-activated prodrugs for the treatment of patients with colorectal cancer

Research Project

Project/Area Number	19K09114
Research Institution	The University of Tokyo
Principal Investigator	金子学東京大学, 医学部附属病院, 助教 (10790850)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	石原聡一郎東京大学, 医学部附属病院, 教授 (00376443) 田中敏明東京大学, 医学部附属病院, 講師 (30647540) [Withdrawn] 畑啓介東京大学, 医学部附属病院, 特任講師 (60526755) [Withdrawn] 野澤宏彰東京大学, 医学部附属病院, 准教授 (80529173) 川合一茂東京大学, 医学部附属病院, 講師 (80571942)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2022-03-31
Keywords	大腸癌 / mTOR阻害剤 / 低酸素プロドラッグ / 血管新生
Outline of Annual Research Achievements	1年目の本年度は、mTOR阻害剤単剤、低酸素プロドラッグ単剤、および両者の併用が大腸癌細胞株に及ぼす影響についての検討を、条件を変えながらin vitroで行った。まず、mTOR阻害剤単剤での大腸癌細胞の抑制効果を検討した。mTOR阻害剤単剤で大腸癌細胞の増殖を濃度依存的に抑制することをMTS assayで確認した。増殖抑制の機序の検討として、apoptosisの誘導をFlow-cytometryを用いて測定したところ、あまりapoptosisは誘導されていなかった。そこで、Cell cycleについてFlow-cytometryを用いて測定したところ、G1期の細胞が増加していることがわかった。さらに、Western blot法にてmTORやその下流の蛋白発現について検討したところ、p-p70S6Kやp-4E-BP-1などの細胞増殖に関わる蛋白の発現が減弱されていることがわかった。次に、正常酸素環境下、低酸素環境下において、低酸素プロドラッグ単剤での大腸癌細胞株の抑制効果を検討した。まず低酸素プロドラッグそのものの大腸癌細胞株に及ぼす影響について検討した。条件を変えて検討してみたが、十分な効果が得られなかった。つづいて低酸素プロドラッグの還元・活性化型の大腸癌細胞株への影響について検討したところ、大腸癌細胞の増殖を抑制濃度依存的に抑制することがわかった。増殖抑制の機序の検討として、apoptosisの誘導をFlow-cytometryを用いて測定したところ、低酸素プロドラッグ活性化型によりややapoptosisは増加していることがわかった。Cell cycleについてFlow-cytometryを用いて測定したところ、G1期の細胞が増加していることがわかった。現在、mTOR阻害剤と低酸素プロドラッグ/低酸素プロドラッグ活性化型の併用での大腸癌細胞の抑制効果を検討中である。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 低酸素プロドラッグが抗腫瘍効果を発揮するためにはシトクロムP450で還元・活性化される必要がある。大腸癌細胞中のシトクロムP450の量は、細胞株にもよるが概ね少なく、有効な結果が得られにくかった。低酸素プロドラッグの還元・活性化型での検討ではその効果が確認できてたため、in vitroの検討では還元・活性化型を用いて今後の実験を行っていく。また、低酸素環境条件での検討は条件設定が難しく難渋しているが、さらに検討を重ねていく予定である。
Strategy for Future Research Activity	In vitroでの検討をさらに行い、その後にin vivoでの検討を行う。マウス大腸癌細胞のColon26をBALB/cマウスの側腹部に皮下注射する。3週間程度で皮下腫瘍の形成を確認してからmTOR阻害剤単剤、低酸素プロドラッグ単剤、mTOR阻害剤と低酸素プロドラッグ両者を腹腔内に投与する。投与開始後3週目にマウスをsacrificeし腫瘍を採取する。採取した腫瘍を用いて、p-mTOR、p-70S6K, 4E-BP1, cyclin D, HIF-1α, VEGF、 Bcl-2, Bcl-xL, Bax, Caspase-3,8,9, Cleaved caspase-3,8,9, PARP, Cleaved PARPなどの発現を免疫染色、フローサイトメトリー、western blot法などにて行う。