Identification and clinical application of the colon cancer-specific protein markers

2021 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 19K09123
• Research Institution: Ehime University
• Principal Investigator: 渡部 祐司 愛媛大学, 医学系研究科, 教授 (20210958)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 東山 繁樹 愛媛大学, プロテオサイエンスセンター, 教授 (60202272)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 大腸がん / がんマーカー / KLHL5 / CUL3型ユビキチンリガーゼ / 定量質量分析 / NRM解析

Outline of Annual Research Achievements

これまでに、大腸がん細胞の特性（異常増殖・分裂、浸潤・転移）を規定するCUL3型ユビキチンE3リガーゼ複合体CUL3-KLHL5軸を見出し、ヒト大腸がん組織解析での浸潤性とKLHL5発現量の顕著な正の相関性を、さらに、培養大腸がん細胞株でのKLHL5ノックダウン実験から、細胞増殖・分裂、細胞伸展・浸潤を正に制御することを確認している。本研究では、CUL3-KLHL5軸の標的基質の同定を通して、大腸がん診断マーカー分子の探索・同定を行い、その応用を目的とした。
昨年度までに、ビオチン化KLHL5タンパク質を合成し、これをプローブとして当大学が有するヒト20000タンパク質アレイを用いて探索した結果、約100種のKLHL5標的基質候補タンパク質を選別した。さらにこれらのタンパク質の約60種について、質量分析で検出可能な複数のプロテオテイピックペプチド (Proteotypic peptide : PTP)を決定した。次に、PTPを繋ぎ合わせた安定同位体標識人工タンパク質QconCAT (Quantification Concatamer)を作製し、これを定量用内部標準タンパク質として用いることで、Maltiple Reaction Monitoring (MRM)法による定量解析基盤の構築を進めた。
2021年度では、MRM法による定量解析基盤の構築を継続して行った。また、大腸がん細胞株 HCT116およびSW480細胞を用いてsiKLHL5 RNA処理を施し、KLHL5遺伝子ノックダウン下で発現が上昇する基質候補分子を細胞可溶性抽出画分および培養上清画分を用いて、MRM法による定量解析により探索・同定を進め、現在も継続して解析中である。