2019 Fiscal Year Research-status Report

がん細胞ゼブラフィッシュ移植モデルによるアッセイ系の構築～膵癌克服への布石～

Research Project

Project/Area Number	19K09135
Research Institution	Osaka Medical College
Principal Investigator	朝隈光弘大阪医科大学, 医学部, 講師 (40559390)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	小村和正大阪医科大学, 医学部, 講師 (10789853) 廣瀬善信大阪医科大学, 医学部, 教授 (20293574) 小野富三人大阪医科大学, 医学部, 教授 (70743996) 谷口高平大阪医科大学, 医学部, 助教 (70779686)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2022-03-31
Keywords	ゼブラフィッシュ / 癌移植 / 膵癌
Outline of Annual Research Achievements	患者由来がん細胞移植（Patients-derived xenograft: PDX）は、患者由来の遺伝的特徴や不均質(Heterogeneity)を保持し、がん関連線維芽細胞・腫瘍随伴マクロファージなどのがん微小環境を含んでおり、細胞株の二次元培養よりも臨床を反映するとされている。移植モデルとしては免疫不全マウスが使用されることが多いが、本研究では、透明で生体内動態観察に優れたゼブラフィッシュの高いがん生着能に注目し、がん移植モデルとしての応用を試みる。マウスと比較して低コストで生産能の高いゼブラフィッシュモデルが、生体内におけるがん細胞の動態（生着・転移・増殖）と、周囲組織の微小環境を定量化し、抗がん剤の効果予測ツールとなり得るか評価する。予備実験として移植後にダイナミックな変化をきたすことが知られているメラノーマ細胞株（B-16）をゼブラフィッシュ稚魚に移植する実験を行った。受精後２日のゼブラフィッシュ稚魚の卵黄嚢に50～100個程度の予めGFPが導入されたメラノーマ細胞をマイクロインジェクションし、蛍光顕微鏡にて経時的に観察を行った。移植後３日目でがん細胞の増殖や、尾部への転移が確認された。次に膵臓がんも同様に移植後の動態を評価するため、GFP遺伝子を導入したヒト膵癌由来細胞（Panc-1）をメラノーマ細胞と同様にゼブラフィッシュ稚魚に膵臓がん細胞を移植したところ、がん細胞の生着と転移がみられた。ここで膵臓がんにおいて臨床上問題となることの一つに神経への浸潤があることに着目し、膵臓がんの神経浸潤モデルを作ることを試みた。具体的には、ゼブラフィッシュ神経蛍光モデルの脊髄の近傍に膵臓がん細胞を移植し、移植がん細胞の神経への浸潤を解析する。光学顕微鏡での観察では、膵臓がん細胞の脊髄周辺への生着が確認され、今後病理学的な検討を加える予定である。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 今年度は一般的なゼブラフィッシュの取り扱いや、がん細胞をマイクロインジェクションにてゼブラフィッシュ稚魚に移植する手技を獲得することを目標としていた。結果として、初回はメラノーマ細胞株（B-16）、続いて膵臓がん細胞株（Panc-1）を移植して生着と転移が確認できたため、おおむね順調に進展していると自己評価している。今後検討すべき課題は、ゼブラフィッシュ膵臓がん神経浸潤モデルを確実に生産し、さらに効率化することである。従来のゼブラフィッシュがん移植モデルはがん細胞をゼブラフィッシュ稚魚の卵黄嚢にマイクロインジェクションするため大量生産が容易であるが、現在作成している膵臓がん神経浸潤モデルは移植する部位の組織の密度の違いからインジェクションの難易度が高く、現状は卵黄嚢に移植する場合と比較して大量生産が困難である。
Strategy for Future Research Activity	膵臓がん神経浸潤モデルをより大量に生産し解析を進めるため、移植するがん細胞溶液の密度やマイクロインジェクションに使用するガラス針などの移植実験を行う際の条件を詳細に検討中である。また今後、病理標本の作成方法も検討が必要である。さらに、膵臓がん細胞の神経浸潤に特異的な免疫組織化学染色による評価も試みる予定である。
Causes of Carryover	本年度は予備実験に時間を要したため支出が少なかったが、次年度にゼブラフィッシュ癌移植モデルの免疫染色の抗体やトランスジェニックモデルの購入等を計画している。