2020 Fiscal Year Research-status Report

がん細胞ゼブラフィッシュ移植モデルによるアッセイ系の構築～膵癌克服への布石～

Research Project

Project/Area Number	19K09135
Research Institution	Osaka Medical College
Principal Investigator	朝隈光弘大阪医科大学, 医学部, 講師 (40559390)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	小村和正大阪医科大学, 医学部, 講師 (10789853) 廣瀬善信大阪医科大学, 医学部, 教授 (20293574) 小野富三人大阪医科大学, 医学部, 教授 (70743996) 谷口高平大阪医科大学, 医学部, 講師 (70779686)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2022-03-31
Keywords	ゼブラフィッシュ / 膵臓癌
Outline of Annual Research Achievements	患者由来がん細胞移植（Patients-derived xenograft: PDX）は、患者由来の遺伝的特徴や不均質(Heterogeneity)を保持し、がん関連線維芽細胞・腫瘍随伴マクロファージなどの、がん微小環境を含んでおり、細胞株の二次元培養よりも臨床を反映するとされている。移植モデルとしては免疫不全マウスが使用されることが多いが、本研究では、透明で生体内動態観察に優れたゼブラフィッシュの高いがん生着能に注目し、がん移植モデルとしての応用を試みる。マウスと比較して低コストで生産能の高いゼブラフィッシュモデルが、生体内におけるがん細胞の動態（生着・転移・増殖）と、周囲組織の微小環境を定量化し、抗がん剤の効果予測ツールとなり得るか評価する。本研究では最も予後不良な悪性腫瘍の一つである膵臓がんについて、ゼブラフィッシュ移植モデルでのがん細胞の動態を観察・評価することで予後の改善に繋がる知見を得ることを目標としている。膵臓がんの病理学的な特徴の一つである神経浸潤に着目し、まず神経浸潤モデルの確立を目指した。がん細胞を確実にゼブラフィッシュ稚魚の神経管内に移植する手技を検討し、それが可能であることを見出した。これにより効率的に神経浸潤モデルを作成することができ、がん細胞が神経管内に定着する条件やそれに関わる分子を解析する予定である。解析を進めることで膵臓がんの神経浸潤を抑制する治療法の開発に繋がることが期待される。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 膵臓がんを移植したゼブラフィッシュの生体内で観察するため、まずレンチウイルスを用いてGFP遺伝子をヒト膵癌由来細胞（Panc-1）に導入した。予備実験として、広く行われているゼブラフィッシュ稚魚の卵黄嚢に膵臓がん細胞を移植したところ、がん細胞の生着と転移がみられた。ここで膵臓がんにおいて臨床上問題となることの一つに神経への浸潤があることに着目し、膵臓がんの神経浸潤モデルを作ることを試みた。具体的には、ゼブラフィッシュ神経蛍光モデルの脊髄の近傍に膵臓がん細胞を移植し、移植後３日で移植がん細胞と脊髄の関連を解析した。光学顕微鏡での観察では、膵臓がん細胞の脊髄周辺への生着が確認され、病理学的にも観察を行ったところ、脊髄内にがん細胞の定着しているところが観察された。この現象を手技的な面から考察し、色素を注入する実験を行ったところゼブラフィッシュの脊髄内に意図的にがん細胞を移植することが可能であると判明した。また脊髄内に膵臓がんを移植した稚魚は高確率で7日程度生存しがん細胞の定着を認めることが確認された。
Strategy for Future Research Activity	上記のゼブラフィッシュ稚魚の脊髄内に膵臓がん細胞(Panc-1)を移植したモデルをさらに解析し、がん細胞の定着する条件や定着したがん細胞の定量化、また移植された稚魚の運動機能や生体内での分子レベルでの変化を解析する。他の膵臓がん細胞株やゼブラフィッシュ移植モデルで広く使用されるメラノーマ細胞株も使用し比較することで、各種膵臓がん細胞の神経浸潤に関する機序を模索する。
Causes of Carryover	本年度は実験モデルとしての確立を目指してゼブラフィッシュへのがん移植実験を行ってきたため、その解析には至らず次年度使用額が生じた。今後はさらに移植したがん細胞に対する生態の反応として好中球やマクロファージが蛍光標識されたゼブラフィッシュを使用する予定である。また、免疫染色によってがん定着の誘因となる分子の解析も進める。次年度はそれらの費用に研究費を使用する予定である。