膵癌EMTに関するtumor-educated plateletsの応用可能性

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K09194
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 服部 憲史 名古屋大学, 医学部附属病院, 助教 (70744051)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 小寺 泰弘 名古屋大学, 医学系研究科, 教授 (10345879) ; 山田 豪 名古屋大学, 医学系研究科, 講師 (30467287) [Withdrawn] ; 園原 史訓 名古屋大学, 医学部附属病院, 病院助教 (30745534) [Withdrawn]
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 膵癌 / 血小板 / バイオマーカー

Outline of Annual Research Achievements

難治癌である膵癌治療成績向上には、化学療法・放射線療法・手術治療等を組み合わせた集学的治療が不可欠である。本研究では近年、癌細胞との相互作用を有し、発癌や癌の進行にも関連するとされる血小板（tumor-educated platelets：TEP）に含まれる核酸分子の網羅的解析を行い、膵癌のタイプ別分類に有用なTEP関連バイオマーカーを開発し、難治性膵癌に対する個別化集学的治療に貢献することを目的としている。
血小板中のRNAを網羅的に解析するため、high-throughput RNA sequencingを行った。まず、集学的治療を受ける予定である膵癌患者から採取した血液検体より、遠心処理で血小板ペレットを抽出し、そこからtotal RNAを抽出した。まずテストサンプルとして4例の血小板由来total RNAを用い、Agilent 2100バイオアナライザを用いたquality checkを行った。quality checkの結果を基に、Nugen kitによるライブラリ調整を行い、quality checkを行った4例のテストサンプルに対してDNBseqを用いた網羅的mRNA-seqを行った。得られたシーケンス情報はフィルタリング処理され、アダプター配列、コンタミネーションおよび低品質の配列情報は除外された。データフィルタリングの後のシーケンス配列統計学的情報から、血小板から充分なmRNA-seq情報（6Gリード数以上）が得られることが確認され、さらに症例を拡張し、膵癌14例、IPMN 5例、NET 3例、胆管癌3例、SPN 1例および、疾患のないhealthy volunteer 4例の合計30例について上記同様の手法で血小板中mRNA-seq解析を実施し、臨床情報と併せた解析を進行中である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

膵癌、膵癌以外の膵疾患患者の血液から血小板を遠心分離し、そこから抽出したRNAを用いて網羅的mRNA-sequencingを行った。各疾患とhealthy volunteerから抽出された血小板由来mRNAにおける遺伝子の発現状況を比較し、バイオマーカーとして、あるいは疾患特異性を示す可能性がある分子については別の患者群の血液から採取された血小板由来mRNAで検証実験を実施中であり、進捗としてはやや遅れている状況である。

Strategy for Future Research Activity

血小板由来mRNAにおける膵癌および膵癌以外の膵疾患に特異的である分子や膵癌の病勢をモニタリングするのに有用と思われる分子について、さらに症例数を増やして定量PCRによる検証実験を進める。また各分子について細胞株等を用いた機能解析を行うことでそれぞれの分子の疾患に対する影響を及ぼす機序について可能な範囲で明らかにしていく。得られた結果は学会・論文等で社会に発信する。

Causes of Carryover

血小板由来mRNAの網羅的mRNA-sequencingのデータから、有望な関与遺伝子の定量アッセイの確立・遂行に関して、当初の計画より症例を増やしての解析に時間を要したため、次年度未使用額が生じた。また、コロナウイルスの影響により、国内外での情報収集や成果発表に要する計画であった交通費が不要となり、次年度未使用額が生じた。
ここまでの結果から入念にtargetとする遺伝子候補を選定する状況まで到達しており、最終年はこれらの遺伝子候補についてのvalidationの実験に使用する。特に遠隔転移に関わる遺伝子がリストアップされており、膵癌発生・進展・転移の各段階での評価が必要になる。未使用額を使用して、血小板由来mRNA候補の機能解析、臨床検体での発現評価、 in vitro(場合によってはin vivo)環境での機能再現を試みて、膵癌発生や進展に関わる機能の同定を行う。