難治性がん性腹水・胸水治療のための新規免疫細胞療法の開発

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K09196
• Research Institution: Shiga University of Medical Science
• Principal Investigator: 小島 正継 滋賀医科大学, 医学部, 助教 (10452236)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 村田 聡 滋賀医科大学, 医学部, 講師 (90239525) ; 下地 みゆき 滋賀医科大学, 医学部, 技術補佐員 (50796448) ; 目片 英治 滋賀医科大学, 医学部, 教授 (80314152) ; 谷 眞至 滋賀医科大学, 医学部, 教授 (60236677)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 免疫細胞治療 / 養子免疫 / CTL / OX40 / 免疫チェックポイント阻害剤 / がん性腹水 / 腹膜播種性転移

Outline of Annual Research Achievements

免疫トレランスに打ち勝つ癌抗原特異的CTLを癌性腹水・胸水中の免疫細胞TALから樹立するための研究を開始した。
＜マウス腹水モデルによる、TAL由来CTL細胞治療＞
①HER2/neuに特異的な免疫トレランスマウスモデル（HER2/neu transgenic mouse (neu-N)）を用いた。HER2/neu抗原以外には通常の免疫反応が得られ、ヒト癌患者と類似した免疫環境のマウスモデルである。neu-Nマウス の自発乳癌由来癌細胞株(NT2)をneu-Nマウスに腹腔内注した、腹膜播種性転移による癌性腹水モデルを作成した。②癌性腹水からTALを採取。単核球を分離した。③TGF-β陽性細胞除去カラムとTAL由来単核球を接触させ、TGF-β分泌する免疫抑制性の細胞群（制御性T細胞や骨髄由来免疫抑制細胞）を除去した。TGF-β陽性細胞除去カラムはマウス細胞にも作用することが確認できた。④抗原提示細胞（T2-Dq細胞）に、HER2/neu の既知のMHC-class I immunodominant peptideであるRNEU420-429をpulseして、CD8＋T細胞を抗原刺激し、HER2/neu特異的CTLを誘導を試みた。この際、T細胞補助刺激：抗OX40抗体を加えることで、HER2/neu特異的CTLを効率的に誘導できた。抗PD-1抗体を加えてもHER2/neu特異的CTLの誘導はわずかに得られるのみであったが、抗OX40抗体と抗PD-1抗体を組み合わせることにより、それぞれの単剤よりもさらに有効にHER2/neu特異的CTLが誘導できた。
現在、誘導できたHER2/neu特異的CTLの細胞傷害活性の評価と、CTLをneu-Nマウス癌性腹水中へ細胞移入し、1）腹水の減少、２）腹膜播種転移への抗腫瘍効果等を観察しているところである。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

マウスのがん性腹水を用いたの実験系を立ち上げ、HER2に対する免疫トレランスの成立したがん性腹水中のリンパ球からHER2特異的細胞傷害性T細胞が樹立できた。抗OX40抗体や抗PD－１抗体の重要性も示すことができ、次年度からのヒト癌性腹水を用いた研究につながる実績を上げることができたため。

Strategy for Future Research Activity

免疫トレランスに打ち勝つ癌抗原特異的CTLを癌性腹水・胸水中の免疫細胞TALから樹立するための研究をさらに進めていく。
＜マウス腹水モデルによる、TAL由来CTL細胞治療＞
誘導できたHER2/neu特異的CTLの細胞傷害活性の評価を行う。さらに、誘導CTLをneu-Nマウス癌性腹水中へ細胞移入し、1）腹水の減少、２）腹膜播種転移への抗腫瘍効果　を調べ、in vivoでの細胞治療の有効性を示す。
＜ヒト腹水TAL由来癌抗原特異的CTLの樹立＞を開始する。
①胃癌、膵癌、食道癌、乳癌患者の癌性胸水・腹水を採取し単核球と腫瘍細胞を分離。②TGF-β陽性細胞除去カラムで単核球から免疫抑制性細胞（TregやMDSCs）を除去し、CTLが誘導しやすい環境を整える。③WT1やMUC1の全蛋白から得た11aaずつoverlapする15aa長のペプチドを利用した、HLA非拘束性に抗原提示可能となったがん抗原ペプチドカクテルを利用し、T細胞へWT1とMUC1の抗原提示を行う。（抗原提示細胞はB細胞やTGF-βカラム通過した少量のMonocyteやDCを利用、又は腹水から単核球を分離し樹状細胞を誘導したMoDCを用いる）④先行研究で証明した、抗OX40抗体とCTLのin vitroでの接触により、CTLのeffector機能増強とapoptosisの抑制、生体内での分裂能維持機能を涵養する。 ⑤抗免疫checkpoint抗体（抗PD-1抗体や、抗CTLA-4抗体）との接触により、活性化CTL（PD-1やCTLA-4の発現を確認済）のapoptosisを抑制し、担癌患者の免疫抑制状態でも機能維持が可能な、癌抗原特異的CTLを樹立する。⑥抗腫瘍免疫効果判定は患者胸・腹水中癌細胞をターゲットとした、CTLのIFN-γ産生（細胞内IFN-γ染色）で抗腫瘍免疫機能を評価、癌細胞傷害試験で抗腫瘍効果を評価する。

Causes of Carryover

マウスを使用したがん性腹水に対する治療実験はまだ途中であり、マウス飼育費や治療用のCTL大量培養のための細胞培養諸経費の使用が予定より少なかった。次年度に、マウス飼育費および培養経費として充当する予定である。
また、実験に専念するため情報収集のための学会参加を見送ったため、旅費を使用しなかった。幅広く情報収集して研究の進展に役立てるため、国内学会等への参加のための旅費に次年度使用額の一部を充てる予定である。