Identification of cancer stem cells in blood samples of colorectal cancer patients

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K09197
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 井上 彬 大阪大学, 医学系研究科, 招へい教員 (90645053)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 山本 浩文 大阪大学, 医学系研究科, 教授 (30322184)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: CTC / 培養 / 大腸癌 / 遺伝子変異

Outline of Annual Research Achievements

悪性腫瘍の根源とされる癌幹細胞は、自己複製能、多分化能、造腫瘍能を有する少数の癌細胞集団で、治療抵抗性を示し、再発や転移の原因となる。申請者らは、大腸癌患者の血液から循環血液細胞を生きたまま採取し、これを培養することで個々の患者に特異的な癌幹細胞を同定・解析を試みた。研究計画が倫理委員会で承認され、大腸癌患者から10mlの採血から、血中の癌細胞を免疫染色で同定する試みを行った。試行錯誤と反復実験によりステージIVの担癌患者では血中の癌細胞を捕らえることができるようになってきた。すなわちOncoquick細胞分離液を用いて赤血球、白血球、血小板を除去するも、残存する血球成分は依然と多く混在し、特殊ポリマーをコーティングしたスライド上で培養することによりスライドグラス上から血球成分が遊離して癌細胞が残り、EpCAM抗体で染色すると明瞭な核小体とクロマチン増量を示す腫大した核を有する癌細胞が観察できるようになった。癌細胞のスライドグラスからの脱落を防止するには、EpCAM抗体を用いたワンステップ法を適用した。症例を重ねるごとに、ノウハウが蓄積され、癌細胞の染色は高率に成功するようになった。培養も血球成分をダメージなく除去する方法で、スフェロイドの形成を５例に認めた。しかし、大腸癌患者の血中に含まれる癌細胞の個数は少数であることがほとんどであることから、スフェロイドも１、２個しか得られず、シングルセル遺伝子解析に準じた方法で遺伝子解析を行うこととした。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

2020年は4月からCOVID19の影響で、病院への立ち入りが制限され、患者と接する研究も長期の制限を受けた。初年度のペースの４分の１以下に症例蓄積は減じたが、２年間の総括とすればC T Cの捕獲、EpCAM抗体によるワンステップ免疫染色法の確立、培養も少しずつではあるが成功例が出ている。2021年度に挽回したいところであるが、現在も大阪は4月末から緊急事態宣言が発令され患者同意、検体採取を要する本研究はなかなかに厳しい状況にさらされている。

Strategy for Future Research Activity

これまでにCTCから出来たスフェロイドを一つずつ拾い上げて凍結させている。DNAを回収し、全ゲノム増幅をかけて、大腸癌に特異的な遺伝子変異（KRAS, BRAF, PIK3CAなど）をサンガー法で検出するよう実験を進める。またRNAseq 分析によって、正常粘膜、主腫瘍(原発巣)のRNAプロファイルとの違いを見出す。これによって血液中でスフェロイドを作る癌幹細胞集団の遺伝子学的な特徴を明らかとする。