肝組織由来スフェロイド（LTOSs）を用いた複合型肝細胞シートの開発

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K09222
• Research Institution: Fukushima Medical University
• Principal Investigator: 丸橋 繁 福島県立医科大学, 医学部, 教授 (20362725)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 武藤 亮 福島県立医科大学, 医学部, 助手 (10791478) ; 鈴志野 聖子 福島県立医科大学, 医学部, 助手 (20816376) ; 石亀 輝英 福島県立医科大学, 医学部, 助教 (50583358) ; 清水 裕史 福島県立医科大学, 医学部, 講師 (70553709) ; 佐藤 直哉 福島県立医科大学, 医学部, 助教 (90622332)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 肝細胞 / シート技術 / 肝再生 / スフェロイド

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、細胞間接着を有した肝細胞スフェロイド；Liver tissue-originate spheroids (LTOSs)を用いた複合型肝細胞シート(LTOSsシート)の開発を行なっている。
2019年度は、癌組織由来スフェロイド；Cancer tissue originated spheroids (CTOSs)の作製方法を応用し、よりViabilityの高い肝組織の作製に着手した。癌細胞からなるCTOSsの作製方法では、分離や消化の工程での正常細胞の細胞障害が強く、生細胞の抽出が困難であった。そのため、まず正常細胞になるべく刺激を与えず、かつ肝組織として抽出できる分離および消化方法の確立を行なった。肝臓の灌流液の種類や灌流液量、消化酵素濃度や量、消化時間などを調整することで、最終的に生細胞で構成された50～70μmの細胞塊をB6マウス1匹あたり約1.0×10^5個確認した。複合する細胞シートは脂肪由来肝細胞(ADSC)を用いる。ADSCの抽出に関して、B6マウスを用いて全麻下に皮下脂肪組織を摘出し、GentleMACS Dissociatorsを用いたシート作成法の工夫を行い、良好な成績を得た。ADSCに関しては、得られた細胞をFACSスキャンにかけ、CD90.2およびCD29が陽性である事、CD34およびCD31が陰性である事を確認した。
現在は、抽出に成功したLTOSsをcell courceとして利用し、複合型LTOSsシートを作製するための条件を確立するため、in vitro下で様々な条件下で培養実験を行なっている。
また、移植実験に使用する肝障害マウスの作製を行なった。免疫不全マウスに対し四塩化炭素の腹腔内投与を行い、四塩化炭素の量、投与期間、回数などを調整することで、肝障害マウスを作製した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

肝細胞は、細胞分離の工程で細胞障害を受けやすく、高いViabilityを維持した状態、かつ細胞接着を保持した組織塊として抽出することが難しかった。そのため、LTOSsを作製するための最適条件を確立するために時間を要した。
現在は、LTOSをcell sourceとして、in vitro下に複合型LTOSsシートの作製に着手しおり、当初の実験計画からやや遅れてはいるが、進展していると考える。

Strategy for Future Research Activity

In vitro下で、LTOSsをcell sourceとして利用した、複合型LTOSsシートの作製方法を確立する。作製した複合型シートは、免疫染色による機能評価や遺伝子解析を行う。複合型遊離肝細胞シートを作製し、複合型LTOSsシートと比較対照する。
Viabilityの高い複合型シートの作製方法が確立したら、免疫不全マウスの皮下、肝表面などに移植し、移植片の形態評価、機能評価を行なう。また、疾患モデルマウスへの移植も検討している。

Causes of Carryover

本年度の使用器材、薬剤については別の研究で使用したものを一部利用するなどして節約に努めた。そのため、予算を次年度へ繰り越すことが可能となった。